關(guān)欣 李樹春 狄茜 繆時(shí)英 王琳芳

小鼠體內(nèi)生精系統(tǒng)重塑模型的建立

關(guān)欣 李樹春 狄茜 繆時(shí)英 王琳芳

目的建立小鼠體內(nèi)生精系統(tǒng)重塑模型，為在體研究生精相關(guān)基因的功能提供技術(shù)方法。方法以白消安(busulfan)40mg/kg腹腔注射后3～5周雄性小鼠為受體小鼠，以穩(wěn)定表達(dá)GFP的精原細(xì)胞系GC－1spg為供體細(xì)胞，移植入受體小鼠睪丸曲細(xì)精管中，觀察供體細(xì)胞移植后在受體小鼠曲細(xì)精管中的定位、增殖和分化情況。結(jié)果成功建立小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)平臺，并發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞系GC－1spg移植回體內(nèi)環(huán)境后，不但能夠在受體小鼠曲細(xì)精管生存，而且能夠定位于相當(dāng)于精原干細(xì)胞所處的niche中增殖、分化，并產(chǎn)生成熟精子。結(jié)論我們應(yīng)用精原細(xì)胞系GC－1spg成功地建立了小鼠體內(nèi)生精系統(tǒng)重塑模型。

精原細(xì)胞系精子發(fā)生細(xì)胞移植

2．實(shí)驗(yàn)方法:(1)小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射針的制作:拉制顯微注射針，針的尖端不要過長，過渡坡度不要過小，以防止注射時(shí)斷針。將拉制好的注射針尖端斷成相應(yīng)的口徑，注射針的尖端外徑要求在40～60μm。將斷好的針尖端磨制成一定的角度，以方便注射的操作。(2)手術(shù)方法和取材方法:采用乙醚吸入的方式進(jìn)行麻醉，麻醉過程中持續(xù)給藥，在麻醉初期小鼠會間歇性抽搐，之后會很平靜地進(jìn)入深度麻醉。這時(shí)要時(shí)刻觀察小鼠狀態(tài)，主要是看小鼠心臟起伏是否規(guī)律，以防乙醚過量導(dǎo)致小鼠死亡。將麻醉后的小鼠仰臥于操作臺上，固定四肢，用碘酒對腹部皮膚進(jìn)行消毒，在腹部正中切口，約1．0～1．5cm，用小鑷子輕輕夾出一側(cè)睪丸。以小鑷子固定睪丸，使睪丸白膜保持一定的張力。在持針器上固定好玻璃穿刺針，Eppendorf壓力注射器與持針器相連接，通過Eppendorf顯微注射器吸入要注射的細(xì)胞懸液備用，在解剖顯微鏡下將穿刺針刺入睪網(wǎng)，細(xì)胞懸液通過睪網(wǎng)以隨機(jī)的路徑充盈曲細(xì)精管。注射完畢后將睪丸放回腹腔中靠近陰囊的位置。另一側(cè)睪丸作為對照組?？p合手術(shù)切口，縫合處再次以碘酒消毒，小鼠移回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。因?yàn)镚C－1細(xì)胞移植的受體小鼠需要有盡量少或者根本沒有內(nèi)源性生精干細(xì)胞，所以可采用白消安(busulfan)去除內(nèi)源生精干細(xì)胞。將白消安配制成2%的DMSO溶液，劑量:40mg/kg，取4～6周齡雄性小鼠進(jìn)行腹腔注射。完成注射后4周可以進(jìn)行細(xì)胞移植。

結(jié)果

1．建立小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)平臺［1］:完成顯微注射后，在鏡下可觀察到含有臺盼蘭的穩(wěn)定表達(dá)GFP的GC－1 spg細(xì)胞注射液沿著曲細(xì)精管的走向充盈。證明細(xì)胞懸液成功注射進(jìn)小鼠睪丸的曲細(xì)精管內(nèi)(圖1)。

圖1 通過睪網(wǎng)注射后睪丸表面的曲細(xì)精管充滿注射液體

2．GC－1 spg細(xì)胞移植的受體小鼠模型的鑒定:為了提高移植成功率，首先清除受體小鼠內(nèi)源的生精細(xì)胞。使用busulfan處理供體小鼠破壞內(nèi)源生精細(xì)胞，在busulfan處理4周后取小鼠睪丸固定、切片并進(jìn)行HE染色。鏡下觀察正常小鼠睪丸曲細(xì)精管可見各級生精細(xì)胞，管腔內(nèi)有大量成熟精子;busulfan處理組多數(shù)曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞缺失，而Sertoli細(xì)胞間形成較大空隙，僅僅在曲細(xì)精管極少數(shù)的地方可見少量成熟精子(圖2)。

圖2 Busulfan處理4周后的小鼠睪丸切片(HE染色) A．正常小鼠睪丸;B．busulfan 40mg/kg，腹腔注射1次，4周后小鼠睪丸

3．穩(wěn)定表達(dá)GFP的GC－1 spg供體細(xì)胞的制備:采用Lipo2000轉(zhuǎn)染pRNAT/H1．1－GFP質(zhì)粒至GC－1 spg細(xì)胞。24h后加入600μg/ml的潮霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞。約4周后，挑取單細(xì)胞克隆于24孔板，待該細(xì)胞克隆長滿后采用流式細(xì)胞儀分選出帶有綠色熒光的細(xì)胞，用半量潮霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的GC－1 spg細(xì)胞(圖3)。

圖3 熒光顯微鏡觀察pRNAT/H1．1－GFP穩(wěn)定表達(dá)GC－1 spg細(xì)胞

4精原細(xì)胞系GC－1 spg移植后在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)恢復(fù)分化能力:將穩(wěn)定表達(dá)GFP的GC－1 spg細(xì)胞移植受體小鼠睪丸8周后制備冷凍切片，并以Hoechst33258染細(xì)胞核，以羅丹明標(biāo)記的花生凝集素(TRITC－conjugated peanut agglutinin，PNA)染精子頂體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，明顯可見帶有紅色熒光頂體的精子，證明GC－1 spg細(xì)胞在受體睪丸內(nèi)已經(jīng)生成成熟精子(圖4)。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)GFP的GC－1 spg細(xì)胞移植8周后的小鼠睪丸切片圖

討論

精原細(xì)胞系GC－1 spg是一株永生化的細(xì)胞系，它介于B型精原細(xì)胞和前細(xì)線期精母細(xì)胞之間，其某些特性與早期的精原細(xì)胞相同［1］。該細(xì)胞系建立于1992年并一直在體外研究中應(yīng)用，但沒有研究表明該細(xì)胞系能夠在體外分化并產(chǎn)生成熟精子［2～6］。我們通過精原干細(xì)胞的移植方法，把精原細(xì)胞系GC－1 spg移植回睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，研究該細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中是否能夠恢復(fù)分化能力。研究結(jié)果顯示，精原細(xì)胞系GC－1 spg不但能夠在受體小鼠曲細(xì)精管中生存，而且能夠增殖和分化為成熟精子。

在體內(nèi)環(huán)境中能夠維持自我增殖的能力是由于GC－1 spg細(xì)胞具有永生化的特征;通過我們的探索，還發(fā)現(xiàn)了在體內(nèi)環(huán)境中GC－1 spg細(xì)胞還能夠重新獲得分化的能力。精子發(fā)生的維持依賴于精原干細(xì)胞的自我更新以及不斷分化的能力，而分化能力的維持依賴細(xì)胞所處的睪丸特殊的微環(huán)境——niche。niche能夠提供維持精原干細(xì)胞生存、增殖和分化潛能所必須的因子及相關(guān)的相互作用蛋白質(zhì)。niche緊鄰睪丸曲細(xì)精管的基膜，是由Sertoli細(xì)胞包繞形成的腔室，同時(shí)Sertoli細(xì)胞通過分泌一些特殊的因子調(diào)控niche中的生殖細(xì)胞，而Sertoli細(xì)胞與生精細(xì)胞之間的接觸是精子發(fā)生所必須的［7，8］。當(dāng)我們把GC－1 spg細(xì)胞移植到受體小鼠睪丸中，受體睪丸的曲細(xì)精管就為GC－1 spg細(xì)胞提供了適宜分化的niche，使得GC－1 spg細(xì)胞分化出成熟的精子。我們的研究同時(shí)進(jìn)一步證明了niche對精子發(fā)生的重要性。

2002年，為了治療雄性不育以及制造轉(zhuǎn)基因動物，Brinster［9］創(chuàng)建了體外生殖細(xì)胞的移植技術(shù)。然而從原代分離的生精干細(xì)胞的生長和傳代都非常困難，并且操作比較復(fù)雜，最終導(dǎo)致成功率低。針對Brinster的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，我們采用了相對穩(wěn)定的GC－1 spg永生化細(xì)胞系作為轉(zhuǎn)基因新途徑的載體，使得精原干細(xì)胞移植技術(shù)能夠更加簡便和穩(wěn)定。但是這種技術(shù)方法也存在不足，白消安破壞了小鼠內(nèi)源性的生精干細(xì)胞，但是它的毒性較大，可能會抑制小鼠的骨髓造血功能，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致小鼠死亡。如果白消安的用量不足，殘存的生精干細(xì)胞恢復(fù)生長和分化，將對觀察結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾。因此，白消安的使用劑量需要因動物種系、周齡等具體情況進(jìn)行細(xì)致的摸索。

1Hofmann MC，Narisawa S，Hess RA，et al．Immortalization of germ cells and somatic testicular cells using the SV40 large T antigen［J］．Exp Cell Res，1992，201:417－435

2Gomez M，Manzano A，Navarro－Sabate A，et al．Specific expression of pfkfb4 gene in spermatogonia germ cells and analysis of its 5'－flanking region［J］．FEBS Lett，2005，579:357－362

3Giampietri C，Petrungaro S，Coluccia P，et al．FLIP is expressed in mouse testis and protects germ cells from apoptosis［J］．Cell Death Differ，2003，10:175－184

4Wang Y，Song W，Li SC，et al．GC－1 mRHBDD1 knockdown spermatogonia cells lose their spermatogenic capacity in mouse seminiferous tubules［J］．BMC Cell Biol，2009，10:25

5Li SC，Qiao Y，Di Q，et al．Interaction of SH3P13 and DYDC1 protein:a germ cell component that regulates acrosome biogenesis during spermiogenesis［J］．Eur J Cell Biol，2009，88(9):509－520

6Teng Y，Wang Y，F(xiàn)u J，et al．Cyclin T2:A novel miR－15a target gene involved in early spermatogenesis［J］．FEBS Lett，2011，585 (15):2493－2500

7McLean DJ．Spermatogonial stem cell transplantation and testicular function［J］．Cell and Tissue Research，2005，322:21－31

8Oatley MJ，Racicot KE，Oatley JM．Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis［J］．Biol Reprod，2011，84(4): 639－645

9Brinster RL．Germline stem cell transplantation and transgenesis［J］．Science 2002，296:2174－2176

(收稿:2011－12－27)

(修回:2012－03－01)

Establishment of An in vivo Remodeling Model in Mouse Spermatogenetic System．

Guan Xin，Li Shuchun，Di Qian，Miao Shiying，Wang Linfang．National Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

ObjectiveTo establish a remodeling model in mouse spermatogenetic system for the study of spermatogenesis－related gene function in vivo．MethodsMale mice were treated 3－5 weeks with busulfan(40mg/kg)as recipient mice．GC－1 spg cells stably expressing GFP were prepared as donor cells．GC－1 cells were injected into the seminiferous tubules of recipient mouse testis，and then the localization，proliferation and differentiation of donor cells in mouse testis were observed．ResultsThe mouse testis microinjection platform was established successfully，and we observed that stable GC－1 cells could survive，proliferate and differentiate into mature sperms in the seminiferous tubules of recipient mouse testis after transplantation．Conclusionwe successfully established an in vivo remodeling model in mouse spermatogenetic system by application of spermatogonial cell line GC－1 spg．

Spermatogonial cell line;Spermatogenesis;Cell transplantation

精原細(xì)胞增殖分化形成精子是一個復(fù)雜而有序的過程，它經(jīng)過初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞，最終分化成為成熟的精子。由于精子發(fā)生的過程高度復(fù)雜并依賴于體內(nèi)微環(huán)境，所以迄今為止并不能夠在體外模擬精子的發(fā)生，探索研究精子發(fā)生的新方法是急待解決的難題之一。本研究利用永生化精原細(xì)胞系GC－1 spg(spg是以pSV－neo轉(zhuǎn)染后獲得的一株永生化的精原細(xì)胞系)初步建立了小鼠體內(nèi)生精系統(tǒng)的模型，發(fā)現(xiàn)GC－1細(xì)胞系移植入小鼠睪丸曲細(xì)精管后可以繼續(xù)發(fā)育成成熟精子。該模型的建立和完善將為在體研究生精相關(guān)基因的功能提供新的技術(shù)方法。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:精原細(xì)胞系GC－1 spg購自ATCC(www．a(chǎn)tcc．org)。DMSO為Sigma公司產(chǎn)品，NP－30拉針器、MF－900斷針器、EG－400磨針器均為NARISHIGE公司產(chǎn)品、解剖顯微鏡(LEICA)、顯微注射器為Eppendorf公司產(chǎn)品等。實(shí)驗(yàn)用BALB/c小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所。動物常規(guī)飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)的手術(shù)操作、術(shù)后護(hù)理在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所實(shí)驗(yàn)動物中心完成。

國家“973”重大研究計(jì)劃項(xiàng)目(2006CD944002)

100005北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院(清華大學(xué)醫(yī)學(xué)部)基礎(chǔ)學(xué)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

王琳芳，電子信箱:wang．linfang@imicams．a(chǎn)c．cn