丁帆 程秀麗 郝維 高雪 曹濟民

hexarelin的細(xì)胞保護作用研究

丁帆 程秀麗 郝維 高雪 曹濟民

目的研究生長素釋放肽hexarelin是否具有細(xì)胞保護作用。方法利用H2O2作用于RAW264．7巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷模型，以細(xì)胞活性(MTT法檢測)、熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)水平(Western blotting法檢測)等指標(biāo)判斷細(xì)胞損傷及修復(fù)情況，觀察不同濃度hexarelin預(yù)處理不同時間對上述細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷的保護作用。結(jié)果與對照組相比，H2O2造成了明顯的細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷，細(xì)胞活性明顯下降，HSP70蛋白表達(dá)水平似有升高，但與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異; hexarelin預(yù)處理可劑量依賴性地減輕由H2O2所致的細(xì)胞活性下降，且這種作用在hexarelin 10－5mol/L、預(yù)處理2h對細(xì)胞的保護作用最強。單獨用hexarelin預(yù)處理細(xì)胞后，HSP70的表達(dá)即明顯升高。給予hexarelin預(yù)處理，再用H2O2刺激細(xì)胞，HSP70的水平進(jìn)一步升高。結(jié)論Hexarelin具有抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞保護作用，這種作用與其誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)有關(guān)。

生長素釋放肽細(xì)胞保護氧化應(yīng)激

細(xì)胞在受到傷害性刺激后會發(fā)生一系列基因表達(dá)和代謝的變化。在眾多錯綜復(fù)雜的變化中，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)的表達(dá)和功能變化對于細(xì)胞抵抗損傷發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。HSP是廣泛存在于生物體內(nèi)的細(xì)胞應(yīng)激蛋白，也是非常重要的分子伴侶［7］。當(dāng)機體或細(xì)胞受到高溫、缺氧、重金屬、氧自由基等傷害性刺激時，HSP即大量表達(dá)。HSP70是HSP家族中最為保守、作用最顯著的成員，它可以幫助蛋白質(zhì)正確折疊。在應(yīng)激狀態(tài)下，可抑制細(xì)胞氧化損傷，使細(xì)胞凋亡減少，包括減輕化療藥物導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［8］。HSP70可通過增強細(xì)胞對損害的耐受程度，維持細(xì)胞的正常代謝功能，提高細(xì)胞的活性發(fā)揮其細(xì)胞保護作用。因此，在探討hexarelin的細(xì)胞保護作用機制時，本工作重點研究HSP70在其中的角色。

材料與方法

1．材料:RAW264．7巨噬細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心;hexarelin購自Sigma Aldrich公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司;HSP70抗體購自Santa Cruz公司;MTT試劑盒購自Promega公司;RIPA細(xì)胞裂解液及BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自碧云天公司。

2．細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞用含10%血清的DMEM基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至匯合70%～80%后，換用無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于靜止期，分別加入不同濃度hexarelin (10－8、10－7、10－6和10－5mol/L)，分別預(yù)孵育1、2、6、12和24h，收集細(xì)胞用于實驗。

3．細(xì)胞分組:①正常對照組，給予同體積的生理鹽水;②H2O2組，給予H2O2(10－4mol/L)刺激3h;③hexarelin+H2O2組:細(xì)胞與10－5mol/L hexarelin共培養(yǎng)，然后加入H2O2刺激3h。以上3組分別在1、2、6、12和24h時間收樣進(jìn)行MTT實驗。

4．MTT分析:參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作，每組設(shè)6個復(fù)孔，分別加入不同濃度(10－8、10－7、10－6、10－5mol/L)的hexarelin預(yù)孵育1、2、6、12和24h，再用H2O2(10－4mol/L)刺激24h，之后在酶標(biāo)儀上570nm處測定吸光度(A值)。

5．Western blotting分析:棄去細(xì)胞上清，按照說明書指示用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。檢測蛋白濃度后，取同樣質(zhì)量的蛋白樣品50μg，進(jìn)行SDS－PAGE電泳。之后將樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。隨后與相應(yīng)的一抗及二抗反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光法檢測抗原抗體結(jié)合區(qū)帶。用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對電泳條帶進(jìn)行密度掃描，以β－actin為內(nèi)參照進(jìn)行定量分析。

5．統(tǒng)計學(xué)方法:統(tǒng)計軟件為SPSS 13．0，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，用方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1．hexarelin單獨作用對細(xì)胞活力的影響:將不同濃度的hexarelin分別加入到培養(yǎng)液中，用MTT的方法檢測RAW264．7細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，hexarelin大體呈劑量依賴性地促進(jìn)細(xì)胞活性，其中hexarelin在10－5mol/L濃度時的細(xì)胞保護作用最為明顯(P＜0．05)(圖1)，其他濃度的hexarelin對細(xì)胞活性雖似有增高作用，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。因此在隨后的實驗中，均采用hexarelin 10－5mol/L的濃度。

圖1 MTT實驗顯示H2O2和不同濃度hexarelin對RAW264．7細(xì)胞活性的作用

2．hexarelin的抗氧化應(yīng)激損傷作用:用hexarelin預(yù)處理RAW264．7細(xì)胞不同時間，然后給予H2O2造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，觀察hexarelin預(yù)處理是否可減輕由H2O2造成的細(xì)胞活力下降。結(jié)果顯示，H2O2可使細(xì)胞活力明顯下降(圖2)(與對照組相比，P＜0．05);用hexarelin預(yù)處理不同時間(1～24h)均可促進(jìn)細(xì)胞活力的恢復(fù)(圖2)，說明hexarelin預(yù)處理可明顯減輕H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。由于hexarelin作用2～4h后顯示出最強的保護作用，故在隨后的試驗中統(tǒng)一用hexarelin預(yù)處理2h。

圖2 MTT實驗顯示hexarelin對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的保護作用

圖3 Western blotting實驗顯示H2O2和hexarelin對HSP70蛋白表達(dá)的作用

3．hexarelin促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的HSP70表達(dá):用10－5mol/L hexarelin預(yù)處理細(xì)胞2h，然后再用H2O2(10－4mol/L)刺激RAW264．7細(xì)胞3h，以造成氧化應(yīng)激損傷，然后用Western blotting法觀察細(xì)胞的HSP70蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，用H2O2處理的細(xì)胞其HSP70的蛋白表達(dá)似較正常對照組略有升高，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3);10－5mol/L hexarelin單獨作用細(xì)胞2h其HSP70的蛋白表達(dá)水平與正常對照組相比明顯升高，hexarelin預(yù)處理后再加入H2O2(hexarelin+H2O2)，RAW264．7細(xì)胞的HSP70表達(dá)進(jìn)一步升高，提示HSP70在hexarelin的抗細(xì)胞氧化損傷中的重要作用。

討論

氧化應(yīng)激損傷常見于臨床多種疾病及病理過程，如組織缺血/再灌注損傷、敗血癥休克以及多器官功能衰竭等，其發(fā)生的基本機制是活性氧對組織細(xì)胞的損傷，表現(xiàn)為線粒體損傷、細(xì)胞活性的下降，凋亡率升高等。HSP是細(xì)胞在多種理化及生物應(yīng)激原作用下表達(dá)增多的一組蛋白質(zhì)，其中HSP70是HSP家族中與細(xì)胞保護關(guān)系最為密切的一族，它能抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，保護蛋白不受損傷，抑制細(xì)胞的凋亡。在各種應(yīng)激或損傷刺激的情況下，對于HSP70如何發(fā)揮其細(xì)胞保護作用目前尚不明確［9］。就目前研究資料表明HSP70可能從提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性、分子伴侶作用和抗細(xì)胞凋亡作用幾方面發(fā)揮細(xì)胞保護的作用。還有研究表明，熱休克預(yù)處理通過誘導(dǎo)多種熱休克蛋白的表達(dá)干預(yù)線粒體信號通路與死亡受體通路而抑制過氧化氫所致的C2C12細(xì)胞凋亡［10］。

本實驗室近來的研究工作表明，hexarelin可減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化性低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這提示hexarelin具有細(xì)胞保護作用［4，11］。本工作旨在觀察hexarelin是否能通過提高HSP70表達(dá)來增加細(xì)胞活性，降低活性氧對細(xì)胞的損傷，從而發(fā)揮細(xì)胞保護作用。我們首先觀察了hexarelin是否能增加細(xì)胞活性，并確定其最適濃度及作用時間。結(jié)果顯示，hexarelin在10－5mol/L濃度及預(yù)處理2～4h時，抗氧化應(yīng)激損傷和促進(jìn)細(xì)胞活力的作用最為明顯。進(jìn)而我們研究了hexarelin是否能夠通過提高HSP70的蛋白表達(dá)量來發(fā)揮細(xì)胞保護作用。Western blotting結(jié)果表明，單獨給予細(xì)胞hexarelin即可增加細(xì)胞的HSP70表達(dá)水平;給予細(xì)胞hexarelin預(yù)處理后再給予H2O2，細(xì)胞表達(dá)HSP70的量大大增加。表明hexarelin的抗氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞保護作用與誘導(dǎo)HSP70表達(dá)有密切關(guān)系，也提示hexarelin具有細(xì)胞保護藥物的潛在開發(fā)價值。

1Chen C，Wu D，Clarke IJ．Signal transduction systems employed by synthetic GH－releasing peptides in somatotrophs［J］．J Endocrinol，1996，148(3):381－386

2Korbonits M，Grossman AB．Growth hormone－releasing peptide and its analogues Novel stimuli to growth hormone release［J］．Trends Endocrinol Metab，1995，6(2):43－49

3Xu X，Pang J，Cao JM，et al．GH－releasing peptides improve cardiac dysfunction and cachexia and suppress stress－related hormones and cardiomyocyte apoptosis in rats with heart failure［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(4):H1643－1651

4Pang J，Xu RK，Xu X，et al．Hexarelin protects rat cardiomyocytes from angiotensin ii－induced apoptosis in vitro［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286(3):H1063－1069

5Xu X，Pang J，Yin H，et al．Hexarelin suppresses cardiac fibroblast proliferation and collagen synthesis in rat［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(5):H2952－2958

6Pang J，Xu Q，Xu X，et al．Hexarelin suppresses high lipid diet and vitamin D3－induced atherosclerosis in the rat［J］．Peptides，2010，31(4):630－638

7鮑秀琦，劉耕陶．熱休克蛋白:細(xì)胞保護和腫瘤治療的新靶點［J］．藥學(xué)學(xué)報，2008，43(3):234－240

8Samali A，Orrenius S．Heat shock proteins:regulators of stress response and apoptosis［J］．Cell Stress Chaperones，1998，3(4):228－236

9李征宇，趙霞．熱休克蛋白對細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)［J］．中國科學(xué)C輯生命科學(xué)，2004，34(1):6－13

10肖衛(wèi)民，蔣碧梅，石永忠．熱休克蛋白抑制過氧化氫所致C2C12細(xì)胞凋亡的機制［J］．中南大學(xué)學(xué)報，2004，29(1):6－10

11徐啟華，丁帆，代中華，等．Hexarelin對ox－LDL引起的大鼠腦微血管內(nèi)皮損傷的保護作用［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39(7):26－29

(收稿:2012－02－28)

(修回:2012－03－19)

Cytoprotection Effect of Hexarelin．

Ding Fan，Cheng Xiuli，Hao Wei，Gao Xue，Cao Jimin．Department of Physiology and Pathophysiology，Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences，School of Basic Medicine Peking Union Medical College，Beijing 100005，China

ObjectiveTo investigate whether hexarelin could exert antioxidant cytoprotection effects．MethodsUsing H2O2to induce oxidative injury in RAW264．7 macrophage－like cells，we observed if hexarelin pretreatment(with different concentrations and times)could prevent cells against oxidative injury．Cell viability and proliferation were assayed by MTT，and the expression level of heat shock protein 70(HSP70)was evaluated by Western blotting．ResultsCompared with the control cell，H2O2induced significant oxidative injury，as evidenced by a sharp drop in cell viability;the protein expression level of H2O2－challenged cells appeared higher than the control but did not show statistical significance．Pretreatment with hexarelin dose－dependently protected the H2O2－induced decrease in cell viability，and this protection was the most significant when hexarelin was at 10－5mol/L and pretreatment for 2 hours．Hexarelin alone could increase the protein expression of HSP70 in RAW264．7 cells．Hexarelin pretreatment plus H2O2challenging further increased the HSP70 level．ConclusionHexarelin could exert anti－oxidant cytoprotection effect，which is associated with the induction of HSP70 expression．

Hexarelin;Cytoprotection;Oxidative injury

生長激素釋放肽(growth hormone releasing peptides，GHRP)是一類人工合成的、含D型氨基酸殘基的寡肽(一般為6肽)，hexarelin是其中的一種［1］。GHRP的作用與ghrelin相似，均可通過生長激素促泌素受體(GHSR)刺激腦腺垂體釋放生長激素［2］。但隨后的研究發(fā)現(xiàn)GHRP具有不依賴生長激素分泌的外周器官保護作用，其中我們實驗室近年來就GHRP的心血管保護作用開展了系列研究，表明GHRP對心衰、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化和動脈粥樣硬化均有明顯抑制作用［3～6］。這些研究強烈提示GHRP具有細(xì)胞保護作用，包括可能具有減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷的作用，但目前仍沒有直接實驗證據(jù)支持這一推斷。本工作的目的是證明這一推斷是否正確。由于GHRP具有分子質(zhì)量小、口服有效、毒性很低、相對價廉等特點，具有藥物開發(fā)的潛在前景，因此比ghrelin更有開發(fā)價值。本工作以RAW264．7巨噬細(xì)胞為模型，探討hexarelin是否具有抑制由過氧化氫(H2O2)所致的細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷的作用。

國家“973”基金資助項目(2011CB503900)

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理學(xué)和病理生理學(xué)系

曹濟民，電子信箱:caojimin@126．com