閆冰，宋新剛，李尊江

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司， 黑龍江哈爾濱 150069）

無(wú)菌塑料瓶無(wú)菌檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證

閆冰，宋新剛，李尊江

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司， 黑龍江哈爾濱 150069）

無(wú)菌塑料瓶是獸用滅活疫苗的主要內(nèi)包裝材料，滅活疫苗為非最終滅菌的產(chǎn)品，所以要求用于內(nèi)包裝材料的塑料瓶在使用前達(dá)到無(wú)菌。對(duì)無(wú)菌塑料瓶進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，是保證產(chǎn)品質(zhì)量的必要的條件?！吨袊?guó)獸藥典》2005年版要求在對(duì)制品進(jìn)行“無(wú)菌檢驗(yàn)”及“微生物限度檢驗(yàn)”時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以確認(rèn)試驗(yàn)中供試品應(yīng)選擇藥典中所收載的何種供試液制備方法、保種測(cè)定方法，保證“無(wú)菌檢查”或“微生物限度檢查”方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一、樣品與儀器

1.樣品。無(wú)菌塑料瓶，規(guī)格為100 ml/瓶，生產(chǎn)批號(hào)為091134。

2.試驗(yàn)用菌種。金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、生孢梭菌（ATCC11437）、白色念珠菌（ATCC10231）、黑曲菌（ATCC16404）。所有菌株均來(lái)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

3.稀釋液。0.9%氯化鈉溶液，經(jīng)121℃30分鐘高壓滅菌。

4.培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（50 ml/瓶）、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（50 ml/瓶），均為本公司自制，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)及培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)合格。

5.儀器設(shè)備。薄膜過(guò)濾器6套，振蕩儀、生化培養(yǎng)箱。

二、方法與結(jié)果

1.方法。

（1）取樣量：每個(gè)過(guò)濾器取三支塑料瓶，分別加入標(biāo)示量1/2的氯化鈉無(wú)菌水溶液。

（2）每個(gè)過(guò)濾器取三支塑料瓶，分別加入標(biāo)示量1/2的氯化鈉無(wú)菌水溶液，輕輕振搖涮洗內(nèi)壁，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取出濾膜分成兩份，分別接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為供試管。

（3）取3支無(wú)菌塑料瓶，分別加入50 ml的氯化鈉溶液，輕輕振搖涮洗內(nèi)壁，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的金黃色葡萄球菌，過(guò)濾。取出濾膜，加入硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗(yàn)管1。

（4）按上法操作，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的銅綠假單胞菌，過(guò)濾。取出濾膜，加入硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗(yàn)管2。

（5）按上法操作，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的生孢梭菌，過(guò)濾。取出濾膜，加入硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗(yàn)管3。

（6）按上法操作，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的白色念珠菌，過(guò)濾。取出濾膜，加入葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗(yàn)管4。

（7）按上法操作，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的黑曲菌，過(guò)濾。取出濾膜，加入葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗(yàn)管5。

（8）取硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基3瓶和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基2瓶，分別加入以上小于100CFU的試驗(yàn)菌，培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照管。

（9）取硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基各一瓶，作為陰性對(duì)照。

（10）以上各試驗(yàn)瓶均按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，觀察試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)情況。

2.方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 （見(jiàn)表1）。試驗(yàn)管5管中的各試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，顯示塑料瓶采取的滅菌方法對(duì)無(wú)菌檢查結(jié)果的判斷沒(méi)有影響，供試管各管在規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d逐日觀察，供試品管均澄清，陽(yáng)性對(duì)照管生長(zhǎng)良好，判供試品符合規(guī)定。塑料瓶為產(chǎn)品內(nèi)包材，本身無(wú)抑菌作用，通過(guò)方法確認(rèn)塑料的滅菌方法對(duì)無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果的判斷沒(méi)有影響，故按實(shí)驗(yàn)方法建立的方法驗(yàn)試驗(yàn)，可作為無(wú)菌塑料瓶的無(wú)菌檢查，但陽(yáng)性試驗(yàn)菌只選擇金葡萄球菌即可。

表1 方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

三、討論

無(wú)菌塑料瓶在獸藥生產(chǎn)領(lǐng)域使用非常廣泛，建立無(wú)菌塑料瓶的無(wú)菌檢驗(yàn)方法，是獸藥產(chǎn)品質(zhì)量的前提保證。薄膜過(guò)濾法作為無(wú)菌檢查中的一種方法，具有準(zhǔn)確、方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，是無(wú)菌檢查時(shí)所采用的一種重要方法，尤其對(duì)樣品液體量較大的樣本，更有其優(yōu)越性，所以該無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證對(duì)保證結(jié)果的可信度和準(zhǔn)確性具有重要意義。

（略）