馬大勇，韓振蘊(yùn)，范吉平

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門(mén)醫(yī)院腦病科，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院腦病科，北京 100078；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700

參知健腦膠囊是以王永炎院士提出的血管性癡呆 “正虛毒損絡(luò)阻”創(chuàng)新病因病機(jī)學(xué)說(shuō)為指導(dǎo)研發(fā)而來(lái)[1-4]，主要由人參、知母、赤芍等藥物提取物按一定比例優(yōu)化配伍而成[5]，具有扶正通絡(luò)解毒的功效[6-7]，是國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目的候選新藥。

本研究旨在觀(guān)察參知健腦膠囊對(duì)Beagle犬的急性毒理反應(yīng)，為臨床前反復(fù)給藥的毒性研究及臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

參知健腦膠囊由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，批號(hào)：20100907。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5～7個(gè)月齡普通級(jí)Beagle犬6只，雌雄各半，體重：雌性5.85～6.68 kg，雄性 6.45～7.47 kg，由北京瑪斯生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：0165269。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)與管理

在北京昭衍新藥研究中心有限公司普通級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，所有動(dòng)物購(gòu)入后，由獸醫(yī)負(fù)責(zé)檢疫，檢疫馴養(yǎng)期15 d；飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)；動(dòng)物飲用水為符合國(guó)家生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的自來(lái)水，用飲水盆供應(yīng)，外觀(guān)和細(xì)菌指標(biāo)每月檢測(cè)一次；不銹鋼材料籠具，規(guī)格為長(zhǎng)×寬×高＝1 250 mm×800 mm×900 mm，單籠飼養(yǎng)；動(dòng)物房設(shè)定的溫度范圍是18～26℃，實(shí)測(cè)溫度范圍是18～23℃，設(shè)定的濕度范圍是40%～70%，實(shí)測(cè)濕度范圍是29%～66%，光照12 h明暗交替。除實(shí)驗(yàn)方案規(guī)定的禁食時(shí)間外，每只動(dòng)物每天上午和下午各喂食1次，每次喂食150 g左右，動(dòng)物自由攝水；籠具每天沖洗1次，動(dòng)物房地面和墻面每周消毒1次，用0.1%新潔爾滅或0.5%的84 消毒液擦拭消毒，兩種消毒液交叉使用。

1.4 動(dòng)物分組

采用區(qū)段隨機(jī)法分組，即按性別將動(dòng)物分成雌雄兩個(gè)區(qū)段，然后用Excel軟件給出每個(gè)動(dòng)物的隨機(jī)數(shù)，之后將隨機(jī)數(shù)從小到大進(jìn)行排序，將比格犬分為3組，每組雌雄各1只。

1.5 藥物配制

根據(jù)給藥前最近1次的動(dòng)物體重，計(jì)算各組動(dòng)物的給藥量。稱(chēng)取適量供試品，用滅菌注射用水溶解。溶解后的供試品常溫條件下保存使用。

1.6 給藥劑量及方法

首次給藥劑量、給藥濃度、給藥容量見(jiàn)表1。

表1 第1次灌藥劑量

由于中、高劑量組動(dòng)物藥后半小時(shí)左右嘔吐，嘔吐物顏色與給予的供試品相似，考慮給藥量不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。此外，低劑量組動(dòng)物沒(méi)有嘔吐，考慮動(dòng)物嘔吐可能與藥物濃度較高有關(guān)。所以，在首次給藥2 d后，對(duì)中、高劑量組動(dòng)物進(jìn)行了第2次給藥，并對(duì)給藥容量和藥物濃度進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)整，具體見(jiàn)表2：

表2 第2次灌藥劑量

灌胃給藥，低劑量組動(dòng)物給藥1次，中、高劑量組動(dòng)物給藥2次。動(dòng)物灌胃前禁食過(guò)夜，藥后再禁食約1 h。灌胃給藥時(shí)，使用20 ml一次性注射器準(zhǔn)確抽取所需溶液，用16 號(hào)灌胃管經(jīng)口灌胃給藥，每只動(dòng)物給藥完畢后給予約10 ml飲用水沖洗胃管。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 臨床觀(guān)察

一般臨床觀(guān)察內(nèi)容：籠旁觀(guān)察動(dòng)物死亡或?yàn)l死情況、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、進(jìn)食情況、糞便形狀等；詳細(xì)臨床觀(guān)察內(nèi)容：精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、皮膚、被毛、眼、耳、鼻、口腔、腹部、外生殖器、肛門(mén)、四肢、足和呼吸等。

1.7.1.1 給藥當(dāng)天 給藥后籠旁觀(guān)察，1 h內(nèi)連續(xù)觀(guān)察，每隔15 min記錄1次，1～4 h內(nèi)至少每隔1 h觀(guān)察1次；對(duì)未出現(xiàn)明顯異常反應(yīng)的動(dòng)物，4 h后結(jié)束觀(guān)察；對(duì)出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)的動(dòng)物，進(jìn)行1次詳細(xì)臨床觀(guān)察，部分動(dòng)物藥后5 h結(jié)束觀(guān)察。給藥當(dāng)天的籠旁觀(guān)察和詳細(xì)臨床觀(guān)察均記錄在同一張記錄表中。

1.7.1.2 其他時(shí)間 觀(guān)察時(shí)間：檢疫馴養(yǎng)期每天1次一般臨床觀(guān)察；給藥后次日開(kāi)始，每天上午和下午各進(jìn)行1次一般臨床觀(guān)察，第7 天和第14 天進(jìn)行詳細(xì)臨床觀(guān)察，觀(guān)察期為14 d。在同一時(shí)間段，一般臨床觀(guān)察與詳細(xì)臨床觀(guān)察不重復(fù)實(shí)施。

1.7.2 生命體征

1.7.2.1 體重 給藥前、給藥后第7 天和第14 天稱(chēng)重，每次稱(chēng)重均在上午喂食前進(jìn)行。

1.7.2.2 體溫 給藥前、藥后4～5 h、第7 天和第14 天測(cè)量體溫。

1.7.2.3 心電圖 測(cè)定時(shí)間：給藥前、藥后4～5 h、第7 天和第14天，心電指標(biāo)包括心率、P-R間期、Q-T間期和QRS時(shí)限。

1.7.3 血液學(xué)檢查

給藥前、給藥后第7 天和第14 天三個(gè)時(shí)點(diǎn)取血，動(dòng)物前肢皮下靜脈取血；血常規(guī)血樣用EDTA-2K抗凝，用Bayer Advia 2120 全自動(dòng)血球分析儀測(cè)定；血凝血樣用枸櫞酸鈉1∶9 抗凝，分離血漿，使用MC-4Plus四通道血凝儀測(cè)定，用光學(xué)比濁法；血生化血樣不抗凝，取血后2 h內(nèi)分離血清。使用TBA-120FR型全自動(dòng)生化分析儀和Medica Easylyte型全自動(dòng)電解質(zhì)分析儀測(cè)定。

1.7.3.1 血常規(guī) 包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞。

1.7.3.2 血凝 包括凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）。

1.7.3.3 血生化 天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酸磷酸激酶（CK）、尿素氮 （BUN）、 肌 酐 （Cr）、 總 蛋 白 （TP）、 白 蛋 白 （ALB）、 血 糖（GLU）、 總膽紅素 （TBil）、 鉀離子濃度 （K+）、 鈉離子濃度（Na+）、氯離子濃度（Cl-）。

1.7.4 眼科檢查

給藥前以及給藥后第14 天行眼科檢查。檢查方法為通過(guò)肉眼或檢眼鏡觀(guān)察動(dòng)物的眼瞼、結(jié)膜、鞏膜、角膜、前房、虹膜、瞳孔、晶體、玻璃體和眼底有無(wú)明顯異常。

1.7.5 病理檢查

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均進(jìn)行大體解剖，發(fā)現(xiàn)任何組織器官體積、顏色、質(zhì)地等肉眼可見(jiàn)的病變時(shí)，記錄并將有異常改變的組織器官取材并固定于10%中性福爾馬林溶液中，制片并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.8 動(dòng)物麻醉及安樂(lè)死方法

觀(guān)察期結(jié)束（給藥后第15 天）時(shí)，用濃度為30 mg/ml的戊巴比妥鈉溶液，按30 mg/kg的劑量靜脈注射麻醉動(dòng)物，直至動(dòng)物進(jìn)入無(wú)意識(shí)狀態(tài)后，股動(dòng)脈快速放血，將動(dòng)物安樂(lè)死。

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

將不同組別及同一組動(dòng)物給藥前后的體重、體溫、心電圖、血液細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能和血液生化等指標(biāo)直接進(jìn)行比較，綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 不同組別給藥后的臨床觀(guān)察

試驗(yàn)期間，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡或?yàn)l死。低劑量組（1000mg/kg）2只動(dòng)物未見(jiàn)異常反應(yīng)；中、高劑量組的4只動(dòng)物臨床反應(yīng)主要是藥后出現(xiàn)嘔吐和稀便，藥后次日至觀(guān)察期結(jié)束未見(jiàn)異常反應(yīng)。

2.2 不同組別給藥前后體重的變化

試驗(yàn)期間，各劑量動(dòng)物的體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，增長(zhǎng)幅度未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)表3。

表3 不同組別給藥前后體重的變化（kg）

2.3 不同組別給藥前后體溫的變化

試驗(yàn)期間，各劑量組動(dòng)物的體溫基本在正常參考值范圍內(nèi)波動(dòng)，未見(jiàn)與藥物相關(guān)的規(guī)律性變化。

2.4 心電圖

試驗(yàn)期間，各劑量組動(dòng)物的心電參數(shù)在動(dòng)物正常參考值范圍內(nèi)波動(dòng)，未見(jiàn)明顯異常改變。

2.5 血液學(xué)

2.5.1 不同組別給藥前后血細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化

試驗(yàn)期間，各劑量組動(dòng)物的血細(xì)胞計(jì)數(shù)在動(dòng)物正常參考值范圍內(nèi)波動(dòng)，未見(jiàn)有規(guī)律性的明顯異常改變。見(jiàn)表4。

2.5.2 不同組別給藥前后凝血功能的變化

試驗(yàn)期間，各劑量組動(dòng)物的凝血功能指標(biāo)未見(jiàn)有規(guī)律性的明顯異常改變。見(jiàn)表5。

2.5.3 不同組別給藥前后血液生化量的變化

試驗(yàn)期間，各劑量組動(dòng)物的血液生化指標(biāo)在正常參考值范圍內(nèi)波動(dòng)，未見(jiàn)有規(guī)律性的明顯異常改變。見(jiàn)表6。

2.6 眼科檢查

各劑量組動(dòng)物的眼瞼、結(jié)膜、角膜、虹膜、鞏膜、前房、瞳孔、晶狀體、玻璃體和眼底均未見(jiàn)異常改變。

2.7 病理學(xué)檢查

所有動(dòng)物大體解剖觀(guān)察，各組織臟器均無(wú)肉眼可見(jiàn)異常改變。

表4 不同組別給藥前后血細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化

2.8 影響研究可靠性和造成研究工作偏離實(shí)驗(yàn)方案的異常情況

試驗(yàn)期間，飼養(yǎng)室設(shè)定濕度范圍為40%～70%，實(shí)測(cè)濕度范圍為29%～66%，其中有部分時(shí)間段濕度超過(guò)設(shè)定的下限，最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)1.5 h。由于偏離的時(shí)間較短，在此期間未見(jiàn)動(dòng)物因濕度的變化出現(xiàn)相關(guān)的異常表現(xiàn)，故認(rèn)為此項(xiàng)偏離不影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。此外，未見(jiàn)影響研究可靠性和造成研究工作偏離實(shí)驗(yàn)方案的其他異常情況。

表5 不同組別給藥前后凝血功能的變化

3 討論

Beagle犬灌胃給予參知健腦膠囊，當(dāng)給藥劑量為2000mg/kg及以上劑量時(shí)，可見(jiàn)動(dòng)物出現(xiàn)嘔吐和稀便；給藥劑量為1 000 mg/kg時(shí)，未見(jiàn)異常反應(yīng)。2 000 mg/kg劑量組動(dòng)物共給藥2次；第1次給藥容量與1 000 mg/kg劑量組相同，藥物濃度為1 000 mg/kg劑量組2 倍；第2次給藥容量為1 000 mg/kg劑量組的2 倍，藥物濃度與1 000 mg/kg劑量組相同。該組動(dòng)物2次給藥后均發(fā)生嘔吐，嘔吐反應(yīng)發(fā)生時(shí)間為藥后30～40 min，提示動(dòng)物藥后嘔吐與給藥劑量相關(guān)。

第2次給藥后，由于動(dòng)物嘔吐，高劑量組2只動(dòng)物的實(shí)際給藥劑量為2 209 和3 092 mg/kg。由于中、高劑量組動(dòng)物的實(shí)際給藥劑量均大于2 000 mg/kg，且兩組動(dòng)物藥后均可見(jiàn)到稀便，而1 000 mg/kg劑量組動(dòng)物未見(jiàn)該反應(yīng)，提示動(dòng)物稀便與給藥劑量相關(guān)。

中、高劑量組動(dòng)物藥后次日動(dòng)物即恢復(fù)正常，嘔吐和稀便為一過(guò)性反應(yīng)。試驗(yàn)期間，這兩組動(dòng)物的體重、體溫、心電圖、血液學(xué)、血液生化、眼科和大體解剖等檢查均未見(jiàn)明顯異常，表明在本試驗(yàn)條件下，Beagle犬灌胃給予2 000 mg/kg的供試品，耐受性較好。

表6 不同組別給藥前后血液生化量的變化

在本試驗(yàn)條件下，參知健腦膠囊灌胃給予Beagle犬，安全劑量為1 000 mg/kg，最大耐受量（MTD）大于3 000 mg/kg。

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