毋 靜，梁婉怡，鄧家鑫，曲 源，于清宏

南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院風濕免疫科，廣州 510280

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種常見的炎癥性疾病，它以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱慢性炎癥為主要表現(xiàn)。AS由于其低下的生活質(zhì)量和較高的致殘率而受到眾多關(guān)注。AS的治療仍然是全世界風濕病學家面臨的難題，其難點之一是缺乏有效的治療藥物，傳統(tǒng)的改善病情抗風濕藥物（disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs） 治療 AS 的療效有限，眾多風濕病學專家也致力于新研究藥物的開發(fā)和應(yīng)用，以尋找更有效的抗炎藥物。Yokota等[1]研究表明他汀類藥物可下調(diào)類風濕關(guān)節(jié)炎患者由TNF-a引起的IL-6 和IL-8 的增高。Nagashima等[2]研究顯示他汀類藥物可以促進類風濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細胞的凋亡，而且極有希望被用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎[3]。他汀類藥物已經(jīng)在臨床顯示出其有效的抗炎作用，由于此類藥物可以減弱脂多糖的作用，專家們認為其是通過抑制天然免疫起作用的[4]。本研究通過觀察天然免疫分子 Toll樣受體 2（TLR-2）、Toll樣受體 4（TLR-4）在 AS患者外周血單個核細胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的mRNA水平表達以及阿托伐他汀體外干預AS患者PBMC的研究，觀察Toll樣受體（TLRs）的表達差異，探討AS治療的可能的突破點，尋找新的治療AS的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

患者30例，其中，男27例，平均年齡30.6歲；女3例，平均年齡28.6歲，均為風濕免疫科住院AS患者，將其作為AS患者組，均符合1984年修訂的紐約診斷標準[5]，病情活動期，得到患者同意后抽取肘靜脈血12 ml，EDTA抗凝，置4℃保存，另選取健康志愿者30例作為健康志愿者組，兩組年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。阿托伐他汀藥物原粉由北京紅惠公司贊助。RT-PCR引物由上海生物有限公司合成。

1.2 方法

①取4ml靜脈血緩慢加于淋巴細胞分離液上面，2000 r/min，離心20 min。用尖細玻璃管緩慢將分離到的中間層PBMC轉(zhuǎn)入離心管，PBS洗滌2次。離心管底可見白色沉淀，在沉淀中加1.0 ml的Trizol。反復抽吸勻漿液以剪切基因組DNA，將樣品轉(zhuǎn)移到無菌 1.5 ml離心管中，12 000 r/min，4℃，5 min。上清加入200 μl氯仿，劇烈振蕩混勻30 s。室溫放置5 min，12 000 r/min，4℃，10 min。重復上一步驟，吸取上清至另一1.5 ml離心管里加入等體積的異丙醇，混勻靜置數(shù)分鐘。12 000 r/min，4℃，離心10 min。 用70%酒精洗滌沉淀2次，真空離心干燥3～5 min，沉淀用30～50 μl DEPC-H2O溶解。取2.0 μl RNA樣品，紫外分光光度計A260 波長下測得RNA濃度，置-80℃保存。使用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明進行逆轉(zhuǎn)錄。 TLR-4 引物，F(xiàn)orward primer （5′-3′）：5'-GAC CTG TCC CTG AAC CCT A-3'；Reverse primer （5′-3′）：5'-AAA TGT TGC CAT CCG AAA-3'； 擴增產(chǎn)物 380 bp。TLR-2 引物，F(xiàn)orward primer（5′-3′）：5'-GGC CAG CAA ATT ACC TGT GTG-3'；Reverse primer （5′-3′）：5'-CTG AGC CTC GTC CAT GGG CCA CTC C-3'；擴增產(chǎn)物 639 bp。 β-actin引物，F(xiàn)orward primer（5′-3′）：5'-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3'；Reverse primer（5′-3′）：5'-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3'；擴增產(chǎn)物為 592 bp。72℃，7 min，RT-PCR 32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳和電泳條帶分析：Labwork凝膠成像系統(tǒng)紫外光下成像分析，并應(yīng)用附帶軟件分析目標條帶與內(nèi)參β-actin條帶吸光度值之比，進行半定量分析。②取EDTA抗凝血4 ml加入等體積的PBS液稀釋并混勻，將稀釋的血液8 ml加入含有4 ml淋巴細胞分離液的15 ml離心管中，室溫下離心2 000 r/min，20 min。吸取交界處PBMC層并移入另一個15 ml離心管中；加入8 ml PBS混懸細胞；室溫下離心2 000 r/min。20 min，棄上清；用8 ml PBS再次混懸細胞，室溫下離心2 000 r/min，20 min，棄上清；用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液稀釋混懸細胞，分配至24 孔培養(yǎng)板，一份標本轉(zhuǎn)入兩孔，使?jié)舛葹? ×106/孔，總體積為2 ml/孔，一孔用阿托伐他汀（終濃度為0.01 mmol/L）刺激，自身對照孔不予用藥，均在37℃CO2恒溫孵育箱為中連續(xù)培養(yǎng)細胞24 h后，無菌EP管收集，離心后棄上清，留取細胞。用PBS洗滌細胞2次，提取細胞總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及PCR擴增（同上）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0 進行數(shù)據(jù)處理分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周單個核細胞TLR-2 和TLR-4 表達水平對比

①與健康志愿者組比較，AS患者組TLR-2 mRNA表達增高（圖1）。健康志愿者組TLR-2 mRNA表達水平為（0.06 ±0.39），AS 患者組 TLR-2 mRNA 表達水平為 （1.59 ±1.43），AS患者組與健康志愿者組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。②與健康志愿者組比較，AS患者組TLR-4 mRNA表達增高（圖2）。 健康志愿者組TLR-4 mRNA表達水平為 （0.06 ±0.39），AS 患者組 TLR-4 mRNA 表達水平為 （0.60 ±0.73），AS患者組與健康志愿者組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖1 TLR-2 mRNA表達（1、2 為健康志愿者；3、4 為患者）

圖2 TLR-4 mRNA 表達（1、2 為健康志愿者；3、4、5 為患者）

2.2 阿托伐他汀干預對AS患者外周單個核細胞TLR-2 和TLR-4 表達水平的影響

①RT-PCR分析顯示，與空白對照組比較，阿托伐他汀干預組TLR-2 mRNA表達下降 （圖3）。阿托伐他汀干預組（0.59 ±0.44）和空白對照組（1.71 ±1.70）TLR-2 mRNA 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.02<0.05）。②與空白對照組比較，阿托伐他汀干預組TLR-4 mRNA表達下降（圖4）。阿托伐他汀干預組（0.25 ±0.25）和空白對照組（0.96 ±1.04）TLR-4 mRNA 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖3 干預后TLR-2 mRNA表達（1 為對照組，2 為干預組）

圖4 干預后TLR-4 mRNA表達（1 為對照組，2 為干預組）

3 討論

強直性脊柱炎的發(fā)病原因迄今未明，一般認為是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用所致，目前很多學者將強直性脊柱炎劃歸為自身免疫性疾病，其發(fā)病與患者自身的免疫失調(diào)有密切關(guān)系，患者往往存在免疫球蛋白、C反應(yīng)蛋白的顯著變化，除了確診標志 HLA-B27 外，B7，B22，B40，BW42 等與 AS 也密切相關(guān)。Toll樣受體位于細胞膜上，是一種膜蛋白，在抵抗病原體的入侵，即在天然免疫中發(fā)揮重要作用，目前已知參與天然免疫的主要是TLR-2 和TLR-4。當病原體及其產(chǎn)物與病原體的識別受體結(jié)合后，細胞即活化并釋放大量細胞因子或炎癥遞質(zhì)，參與天然和獲得性免疫的炎癥反應(yīng)[6]。TLR-4被活化后通過NF-κB途徑向細胞內(nèi)傳遞信號，可能由被修飾的脂蛋白引起[7]，脂蛋白可上調(diào)TLR-4 的表達[8]。本研究發(fā)現(xiàn)TLR-2 和TLR-4 與AS有密切的關(guān)系，AS患者外周血單個核細胞表達水平顯著高于健康志愿者，提示TLR-2 和TLR-4可能參與AS的發(fā)病。

他汀類藥物，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，被廣泛應(yīng)用于降低膽固醇和脂質(zhì)調(diào)節(jié)，但最近的研究表明，他汀類藥物有潛在的抗炎及調(diào)節(jié)免疫作用。Van Wissen等[9]報道大樣本試驗證實他汀類可降低C反應(yīng)蛋白的水平。他汀類藥物可以阻止巨噬細胞趨化因子的釋放，延緩趨化反應(yīng)和氧化反應(yīng)，降低NK細胞的體外細胞毒性，抑制抗中性粒細胞胞漿抗體誘導的中性粒細胞的體外激活，這些效應(yīng)提示天然免疫反應(yīng)易受HMG-CoA還原酶抑制劑的抑制[10]。Leung等[11]最近的研究顯示，辛伐他汀在體外能抑制滑膜T細胞和成纖維樣滑膜細胞釋放細胞因子。Methe等[12]實驗表明他汀可以下調(diào)由LPS刺激引起的TLR-4 的升高及其下游信號。他汀類藥物可以抑制核因子κB的表達和活性，從而影響趨化因子、黏附分子、血管壁中單核細胞趨化蛋白-1和其他炎癥相關(guān)蛋白的表達。他汀類藥物有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，包括作用于各種免疫細胞（主要是單核巨噬細胞和T細胞）的聚集、分化、增殖、分泌活動。這些都表明他汀類藥物有非依賴降脂免疫調(diào)節(jié)的作用。這些發(fā)現(xiàn)為指示他汀類藥物可能作為一種新的免疫抑制劑提供了肯定的科學理論，本實驗顯示阿托伐他汀可以抑制天然免疫的重要分子TLR-2、TLR-4 的表達，意味著阿托伐他汀可能作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于AS的治療。

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