盧寶全，尚小明，楊 峰，韓德昌，李相春，洪 軍

(1.唐山工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，唐山 063000;2.唐山工人醫(yī)院心內(nèi)科，唐山063000;3.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，唐山 063000;4.唐山工人醫(yī)院核磁共振室，唐山 063000;5.唐山工人醫(yī)院神經(jīng)外科，唐山 063000)

應(yīng)用手持激光器建立光化學(xué)法腦梗死動物模型

盧寶全1，尚小明2，楊 峰3，韓德昌4，李相春4，洪 軍5

(1.唐山工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，唐山 063000;2.唐山工人醫(yī)院心內(nèi)科，唐山063000;3.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，唐山 063000;4.唐山工人醫(yī)院核磁共振室，唐山 063000;5.唐山工人醫(yī)院神經(jīng)外科，唐山 063000)

目的 應(yīng)用手持激光器作為光源建立光化學(xué)法局灶性腦梗死動物模型。方法 將36只SD大鼠隨機分為4組，即A組:開骨窗至硬腦膜，不注射玫瑰紅，手持激光器照射5 min;B組:開骨窗至硬腦膜，注射玫瑰紅，手持激光器照射5 min;C組:保留顱骨內(nèi)板，注射玫瑰紅，手持激光器照射5 min;D組:開骨窗至硬腦膜，注射玫瑰紅，冷光源照射40 min。于術(shù)后24、48 h對各組大鼠進行神經(jīng)功能的行為學(xué)評分，進行 MR掃描，術(shù)后48 h處死動物，TTC染色測量梗死體積，光鏡下觀察病理改變，比較各組的模型制作成功率。結(jié)果 不同方法進行動物模型制作時，24h神經(jīng)功能的行為學(xué)評分有顯著性差異，48 h后差異消失。頭部 MR掃描顯示，A組未見腦梗死形成，B組、C組全部有腦梗死灶形成，D組僅部分大鼠形成梗死灶，但體積明顯較B、C組小，另外C組有2例合并硬膜外血腫。TTC染色A組未見梗死灶形成，B組、C組可見恒定的梗死灶，D組僅部分形成梗死灶。B、C、D組模型制作成功率分別為100%、80%、50%，將B組、C組合并為手持激光器組，與冷光源組(D組)比較，兩種方法間有顯著性差異(P=0.026)。結(jié)論 應(yīng)用手持激光器作為照射光源與冷光源相比，有更高的模型制作成功率。

腦梗死;光化學(xué)法;大鼠

為研究腦梗死及相關(guān)腦動脈病變的發(fā)生發(fā)展機制，拓寬防治措施，驗證治療效果等，需建立相應(yīng)的動物模型，為此，國內(nèi)外學(xué)者做了大量探索［1－3］。對于局灶性腦梗塞動物模型，最常采用線拴法阻斷大腦中動脈血流，雖梗塞體積較恒定，但損傷較大［3］。而對于微小動脈病變所致腦梗死動物模型的研究較少，自發(fā)性高血壓、微栓塞等均可造成微小動脈閉塞，但數(shù)量、部位難以控制，不利于實驗研究［4－6］。光化學(xué)法血栓形成 (photochemically induced thrombosis，PIT)腦梗死模型的制作是利用特定波長的光照與注入血液中的光敏劑發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮后引起一系列凝血反應(yīng)，導(dǎo)致血栓形成。照射皮層可以造成特定區(qū)域微小動脈閉塞，形成面積相對恒定的梗死，有利于腦保護等研究［7，8］，且相對于機械性阻塞血流的方法，具有損傷輕，手術(shù)簡單等優(yōu)點，其對動脈內(nèi)皮損傷模擬了一種人類的發(fā)病機制。

在光化學(xué)法動物模型制作過程中，照射光源一般使用氦氖激光或者冷光源，前者價格昂貴而后者輸出光強較弱。目前，不同波長的手持式激光器(激光手電或激光筆)已得到普及，其發(fā)出的激光波長范圍非常適合光化學(xué)反應(yīng)，且價格低廉，但未有應(yīng)用于動物模型制作中的報道，故本研究對此進行探索。另外，比較了去掉顱骨與保留內(nèi)層骨皮質(zhì)的實驗效果，以便于確定一種可靠地、簡便易行的局灶性腦梗死模型制作方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠36只，體重200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號 SCXK(京)2006－0009，清潔級(SPF)，自然光照，環(huán)境安靜，自由進食飲水，飼養(yǎng)溫度20～28℃，相對濕度40～70%，模型制作前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑配置及儀器使用方法

1)將玫瑰紅 B(RB，分子量為 1017.6)溶于0.9%生理鹽水中配成濃度為3.3%的溶液避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2)冷光源:應(yīng)用250W金屬鹵化燈為發(fā)光光源，光導(dǎo)纖維輸出，外接546 nm濾波片，使之投射出單一綠色光束。手術(shù)時用帶有5mm直徑小孔的黑色避光紙遮蔽周圍組織。

3)手持式激光器(波長532 nm，可調(diào)焦):手術(shù)時調(diào)焦，使照射范圍直徑為5mm。

1.2 實驗方法

1.2.1 光照度穩(wěn)定性測定

固定冷光源及手持激光器后，應(yīng)用數(shù)字照度計(MasTech－LX1010B，深圳華誼公司)測量二者的光照度，每10s鐘采樣一次，時長5min。計算平均值、標準差，由此求的變異系數(shù)，比較二者有無差異。

1.2.2 動物分組

選擇250～300 g大鼠36只，根據(jù)預(yù)實驗及文獻報導(dǎo)［7，9］，將大鼠隨機編號后分為4組，A 組6只，其余組各有10只。A組:開骨窗至硬腦膜，不注射玫瑰紅，手持激光器照射5 min;B組:開骨窗至硬腦膜，注射玫瑰紅，手持激光器照射5 min;C組:保留顱骨內(nèi)板，注射玫瑰紅，手持激光器照射5 min;D組:開骨窗至硬腦膜，注射玫瑰紅，冷光源照射40 min。

1.2.3 動物模型的制作

將大鼠稱重，按照0.3mL/100g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，利用立體固定架前端的門齒環(huán)以及雙側(cè)的耳釘，對大鼠頭部進行固定。之后沿頭正中線切開皮膚，長度約1.5cm，分離暴露顱骨，以矢狀縫左側(cè)3mm，冠狀縫后3mm為中心，磨鉆打開直徑約5mm的骨窗，保留硬腦膜。C組僅鉆透顱骨的外板及板障，保留內(nèi)板并打磨平整。除A組外，按照30 mg/kg劑量于尾靜脈注入3.3%的玫瑰紅，持續(xù)時間約2～3 min，隨后用冷光源或手持激光器照射目標區(qū)域，照射距離為3mm，照射時間依分組而定。照射結(jié)束后局部用慶大霉素鹽水沖洗，縫合頭部傷口，待生命體征恢復(fù)平穩(wěn)后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 動物觀測指標

1.3.1 神經(jīng)功能的行為學(xué)評分

參考 Bederson5 級分級法［10］，于術(shù)后 24 h、48 h對各組大鼠進行神經(jīng)功能的行為學(xué)評分。

1.3.2 頭部核磁共振(MR)掃描檢查

于術(shù)后24 h對大鼠頭部進行MR掃描，檢查前5 min腹腔注射10%水合氯醛麻醉。單獨或2～4只同時固定于自制的泡沫板上，使用關(guān)節(jié)線圈對大鼠頭部進行掃描，掃描層面間距為2mm。

1.3.3 腦梗死體積測定及病理學(xué)檢查

術(shù)后48 h大鼠麻醉后迅速開胸，剪開右心耳，從左心室給予生理鹽水100mL灌洗，斷頭取腦，－20℃冰箱凍保存20 min。對于所取腦組織，用標尺在腦表面正中線以2mm等分，用病理切片機從視交叉前1mm左右冠狀位切腦，其后間隔2mm連續(xù)做6個冠狀切片。每組隨即抽取2個標本用于HE染色，其余用于腦梗死體積測定。

1.3.3.1 腦梗死體積測定

將所需標本放入 2%TTC液，37℃下孵育 20 min(10 min后翻面)，正常腦組織染成紅色，梗死灶染成白色。染色后置于4%多聚甲醛固定，24 h后用 Olympus數(shù)碼相機攝相后輸入電腦，應(yīng)用Imagine－pro plus6.0版測量各層面的梗死面積，將梗死灶面積乘以層厚2mm得出每個層面的梗死灶體積，相加各層面的梗死灶體積即得出整個腦組織的梗死灶體積。

1.3.3.2 病理學(xué)檢查

將所需的腦組織切片置于4%多聚甲醛固定24 h以上，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后將腦組織切片，厚度約4 μm，37～38℃水浴展片，普通載物片撈片，置60℃烤箱中1 h，蘇木精－伊紅染色，樹膠封片。

1.3.4 模型制作成功率

模型制作成功的條件:①MR檢查及TTC染色可見梗死灶形成，或得到光鏡下病理觀察驗證;②模型制作后24 h內(nèi)出現(xiàn)過神經(jīng)行學(xué)異常;③未出現(xiàn)血腫及其它嚴重并發(fā)癥，48 h內(nèi)存活。同時滿足以上條件者為模型制作成功，除以同組大鼠的數(shù)目即為模型制作成功率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16.0 for windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用Kruskal－Wallis非參數(shù)檢驗，當差異具有顯著性時(P＜0.05)，采用 Mann－Whitney非參數(shù)檢驗來分析組間的差異。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間的比較用單因素方差分析，兩組間率的比較用χ2檢驗，必要時用Fisher確切概率法。P=0.05為顯著性檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 光照強度穩(wěn)定性測定

冷光源光照度為7.20±0.67×103勒克斯(Lux)，手持激光器的光照度為(1.29±0.11)×105Lux，后者是前者的18倍。光照度變異系數(shù)冷光源為9.3%，手持激光器為8.5%，并無顯著性差異(P=0.53)。

2.2 一般情況及神經(jīng)行為學(xué)評分

48 h內(nèi)36只大鼠無死亡出現(xiàn)。麻醉清醒后，大鼠精神萎靡，活動及攝氏減少，術(shù)后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分多在2分以下，C組有兩只大鼠評分達到3分，后證實為合并硬膜外血腫。術(shù)后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分，各組間存在顯著性差異(P=0.000)，進一步進行兩兩比較，顯示A組與B組、A組與C組、D組與B組、D組與C組之間存在顯著性差異(P＜0.05)。48h后神經(jīng)行為缺損多有明顯好轉(zhuǎn)，各組間神經(jīng)行為學(xué)評分無顯著性差異(P=0.2)，見表1.

2.3 頭部MR掃描情況

術(shù)后24 h頭部MR掃描顯示，A組未見腦梗死形成，B組、C組全部有腦梗死灶形成，D組僅部分大鼠形成梗死灶，但體積明顯較 B、C、小。另外 C組有2例合并硬膜外血腫(圖1)。

2.4 TTC染色梗死體積測定

TTC染色可見正常腦組織著深紅色，梗死腦組織呈白色(彩插4圖2)。A組未見梗死灶形成，B組、C組全部于左側(cè)照射區(qū)形成部位恒定的梗死灶，局部腦組織蒼白、腫脹明顯，冠狀面成“碗型”，尖端指向側(cè)腦室，深達皮質(zhì)全層，體積為 B組16.7±3.23mm3，C 組 15.6 ±2.85mm3，二者間無顯著性差異(P＞0.05)。D組僅部分形成梗死灶，且體積(5.2±1.96mm3)明顯小于 B組、C組(P＜0.01)。

表1 模型制作后24 h(括號內(nèi)為48 h)的神經(jīng)功能缺損評分Tab.1 Numbers of rats with different neurological deficit score on 24hrs and 48hrs after PIT stroke model made in four groups

圖1 各組大鼠術(shù)后24 h頭部MR掃描，示B、C、D組照射區(qū)梗死灶，C組可見硬膜外血腫Fig.1 MR scanning on 24 hrs after PIT stroke model made in four groups，showed the ischemic lesion of rat brain in group B，C and D，an epidural hematoma appeared simultaneously in a rat from group C

2.5 腦組織病理學(xué)檢查

A組大鼠光鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)規(guī)整，細胞核完整。大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞層次清晰，神經(jīng)元邊界清，錐體細胞突起明顯，胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻、色淡，核仁清晰、染色較深，胞漿無水腫表現(xiàn)，內(nèi)皮細胞及周圍間隙形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。

B組、C組大鼠腦標本鏡下觀察，HE染色可見病灶與周圍組織分界清楚，梗死灶內(nèi)腦組織軟化，細胞碎裂，胞漿液化，核固縮或偏位，細胞溶解后形成的格子細胞等。神經(jīng)元呈不同程度的缺血性改變，腫脹的神經(jīng)元胞漿淡染，呈圓形或橢圓形，皺縮的神經(jīng)元染色深，胞體小，呈三角形。許多神經(jīng)元外形不易辨認，大部分細胞結(jié)構(gòu)消失，胞漿空泡樣變性。病灶中心微血管內(nèi)血栓形成及淤血，壞死邊緣區(qū)可見中性粒細胞浸潤。

D組的兩只大鼠之中一只存在小的梗死灶，另一只未見異常。

2.6 模型制作成功率比較

B組、C組、D組模型制作成功率分別為100%、80%、50%，將B組、C組合并為手持激光器組，與冷光源組(D組)比較，經(jīng)確切概率法驗證，兩種方法間有顯著性差異(P=0.026)。

3 討論

目前局灶性腦梗死模型制作時需要結(jié)扎動脈或機械性阻塞遠端血流，創(chuàng)傷大，且技術(shù)操作具有一定難度，一些學(xué)者開始探索相對簡單的局灶性腦缺血模型。方法之一是在顱內(nèi)注射血管收縮物質(zhì)如內(nèi)皮素，以造成局部缺血［11］。這種方法已在大鼠得到重復(fù)驗證，但在小鼠上制作時，則需結(jié)合其他藥物注入或血管結(jié)扎才能形成梗死灶［12］。另外，此方法雖然簡便，但形成的缺血灶部位不確切，而且死亡率并不低。光化學(xué)法制作腦梗死模型由Watson等［13］于1985年首次報道后，已得到廣泛應(yīng)用［14，15］。其原理是由注入動物體內(nèi)特殊的光敏物質(zhì)即光敏劑，在特定波長的光源照射下，誘發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生并釋放活性氧自由基，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損害，引發(fā)血小板聚集粘附，形成血管內(nèi)血栓，閉塞血管，導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，最終發(fā)生不可逆組織損傷。

光化學(xué)法腦梗死動物模型的制作，光敏劑和照射光源是兩個主要條件。玫瑰紅B是迄今已知最強的光敏劑，其最大吸收波長為549 nm。照射光源國內(nèi)多應(yīng)用冷光源，配合濾光片，光導(dǎo)纖維輸出單色光，照射時間 8～30 min 不等［9，16，17］。為提高照射效果，我們將冷光源照射時間設(shè)定為40 min，模型制作成功率仍低于手持激光器組，且腦梗死體積多小于預(yù)期。其原因可能為玫瑰紅B雖為強光敏劑，但所需光照強度大，自制的冷光源輸出的光照度低，僅為手持激光器的1/18，雖增加時間仍難以滿足需要。而手持激光器不僅光照度高，我們所進行的穩(wěn)定性測定，也證明了短時間內(nèi)穩(wěn)定性強，不會很快出現(xiàn)光照強度衰減的現(xiàn)象，相信隨著大容量充電電池的應(yīng)用，其光照強度可以在較長時間內(nèi)保持，更加適合于實驗研究。另外，該研究中不注射光敏劑的A組，手持激光器照射5 min并未引起局部組織腫脹、壞死，也說明了其安全性，但更長時間的照射是否安全需要進一步驗證。

在光化學(xué)法局灶性腦梗死模型制作過程中，一般需要開骨窗，即去掉顱骨，暴露硬腦膜。但有報道不破壞顱骨或者僅僅去掉顱骨的外板和板障，保留內(nèi)板，適宜光源照射后同樣可以制成局灶性腦梗死模型［18，19］，我們對此也進行了驗證，發(fā)現(xiàn)確實可以在照射方向形成局灶性梗死灶，但少數(shù)大鼠合并出現(xiàn)硬膜外血腫，考慮其原因可能為:顱骨內(nèi)板與硬腦膜之間存在大量的橋靜脈，光化學(xué)反應(yīng)后同樣可以形成血栓，阻塞血流，淤血致一定程度引起靜脈破裂出血，從而造成硬膜外血腫。因此建議模型制作時去掉顱骨為宜。

由于該模型為皮層腦梗死，損害部位僅為皮質(zhì)感覺運動區(qū)，皮質(zhì)下紋狀體、海馬和丘腦未受損，加之大鼠強大的回復(fù)能力，大鼠神經(jīng)行為學(xué)異常輕微，尤其48 h后與無損傷組差異已不顯著，提示在該模型中不宜將神經(jīng)行為學(xué)評分作為干預(yù)因素效果的較長時間觀測指標。即使在經(jīng)典線栓法制備的局灶性腦梗死模型(大腦中動脈栓塞)中，王志強等［20］研究認為大鼠的肢體運動功能與腦梗死體積并無相關(guān)性，48 h內(nèi)肢體運動功能正常的大鼠并不一定不形成梗死灶，同時造模術(shù)后沒有梗死灶的大鼠，也不一定完全沒有神經(jīng)功能缺損癥狀。因此，模型制作成功與否需結(jié)合術(shù)后大鼠的神經(jīng)功能缺損評分、TTC染色后的腦梗死體積、腦組織病理切片的鏡下觀察等方面進行綜合界定。為便于活體判斷，我們又加入了MR掃描檢查，但由于顯示清晰度原因，未作定量分析(梗死面積或體積計算)，僅作為定性判斷。

相比較其它模型制作方法，光化學(xué)法具有梗死部位提前預(yù)知、梗死體積恒定、模型制作成功率高等優(yōu)勢，但目前局灶性腦梗死模型的制作仍以機械性阻斷MCA血流為主，原因之一是照射光源不易獲得，國外多應(yīng)用氦氖激光，價格昂貴，國內(nèi)多應(yīng)用冷光源，雖價格相對低廉，一般實驗室仍難以擁有。近幾年，手持激光器已廣泛普及，其成本更為低廉。經(jīng)我們實驗觀察，在光化學(xué)法腦梗死模型制作時，完全能代替冷光源，且較冷光源更為方便、實用，適合我國開展相關(guān)實驗研究。

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Photochemical Ischemic Stroke Model Made by Hand-held Laser in Rats

LU Bao－quan1，SHANG Xiao－ming2，YANG Feng3，HAN De－chang4，LI Xiang－chun4，HONG Jun5
(1.Department of Neurology，Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China;2.Department of Cardiology，Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China;3.Neurosurgery，Hebei United University Affiliated Hospital，Tangshan 063000，China;4.MRI Scanning Room，Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China;5.Neurosurgery，Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000)

Objective The objective of this study is to observe the effect of photochemical ischemic stroke model made by hand－h(huán)eld laser in rats.Methods 36 rats were randomly divided into four groups:group A，a skull hole was made deep to dura，irradiated by hand－h(huán)eld laser without rose－bengal injection for 5 minutes;group B，a skull hole was made deep to dura，irradiated by hand－h(huán)eld laser for 5 minutes with rose－bengal injection;group C，a skull hole was made deep to inner plate，irradiated by hand－h(huán)eld laser for 5 minutes with rose－bengal injection;group D，a skull hole was made deep to dura，irradiated by cold light source for 40 minutes with rose－bengal injection.Neurological deficit was evaluated 24 and 48 hours after surgery.MR scan was performed at 24 hours and the rats were killed at 48 hours，then the infarct volume was measured by TTC staining and the pathological changes was observed by light microscopy，comparing the success rate between two different irradiation sources.Results The neurological deficit differed at 24 hours but converged at 48 hours.MR scan showed no infarction in group A and some in group D，obvious infarction in all rats from group B and C，but epidural hematoma occured in two rats of group C.TTC staining showed no infarction in group A，an infarctionlesion occurred constantly in the left irradiated region in group B and C，but infarction ocurred only in half of the rats in group D.The successful rate of model－made was 100% 、80%and 50%in group B，group C and group D respectively.Combining group B and group C into hand－h(huán)eld laser group，compared with the cold light source group(group D)，there was a significant difference between two groups(P=0.026).Conclusions In the procedure of photochemical ischemic stroke model made，compared with cold light source，the successful rate was higher when using hand－h(huán)eld laser as the irradiating source.

Ischemic stroke;Photochemically induced thrombosis;Rat

R332

A

1671－7856(2012)09－0063－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.014

2012－08－31