于新迪，王震宇，丁 雷，莫 茜，朱德明，王 偉

(上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心 心胸外科體外循環(huán)科 兒科轉化醫(yī)學研究所，上海 200127)

大鼠肢端缺血預處理對腦缺血后炎癥反應的影響

于新迪，王震宇，丁 雷，莫 茜，朱德明，王 偉

(上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心 心胸外科體外循環(huán)科 兒科轉化醫(yī)學研究所，上海 200127)

目的 通過觀察肢端缺血預處理(limb ischemic preconditioning，LIP)對大鼠腦缺血性損傷后重要炎癥因子表達的影響，探討LIP誘導的腦缺血耐受與炎癥反應之間的關系。方法 選取72只SD大鼠，實驗組(LIP組)30只、缺血組30只和對照組12只。實驗組和缺血組設立5個時間點:6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，每點6只。通過線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的局灶性腦缺血模型及LIP法建立腦缺血耐受模型，采用HE觀察每組大鼠的腦組織形態(tài)學改變、QRT－PCR和ELISA方法檢測腦組織中炎癥因子IL－17及IL－6的表達變化。結果 實驗組腦組織學病理改變明顯輕于缺血組。與缺血組相比:實驗組的IL－17和IL－6的基因和蛋白表達在整體水平均呈下降趨勢;mRNA水平提示實驗組在缺血12 h、24 h和48 h后腦組織中IL－17、IL－6的表達量顯著減少(P＜0.01);蛋白水平提示實驗組在缺血24 h和48 h后腦組織中的IL－6以及在缺血12 h、24 h和48 h后腦組織中IL－17的表達量均降低(P＜0.05)。結論 LIP誘導腦缺血耐受，可以減輕腦缺血后的炎癥反應，對缺血性腦損傷有一定的保護作用。

炎癥反應;神經系統(tǒng);腦損傷;肢端缺血預處理;缺血耐受

腦缺血損傷主要是由免疫系統(tǒng)介導的復雜的病理過程，其中炎癥因子的分泌和炎性細胞的浸潤在這一損傷過程中發(fā)揮極為重要的作用。缺血耐受(ischemic tolerance，IT)是指組織經過一次或多次短暫性缺血復灌后所誘導產生的內源性保護機制，能對以后較長時間的缺血損傷產生顯著的耐受作用，在一定程度上減輕再次缺血所引起的損傷，該現象稱為缺血預處理，其具體機制目前尚不明確［1］。IT的保護作用也存在于不同的器官之間，如肢體、小腸和腎臟等器官的缺血預處理也可對隨后缺血的心、肝等器官產生保護作用［2］，這種現象已經在心肌缺血損傷中得到了證實［3］，但由于血腦屏障的存在，該方法是否對腦缺血性損傷有保護作用尚未被廣泛證實。因此，本研究探討肢端缺血預處理(limb ischemic preconditioning，LIP)和腦缺血損傷的關系，以了解LIP在腦損傷中能否發(fā)揮保護作用以及LIP對炎癥反應的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:選用清潔級健康雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠72只(體重200士20 g)，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。實驗動物許可證號:SCXK(滬)2007－0005，使用許可證號:SYXK(滬)2003－0026。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學標準。

1.1.2 實驗試劑:Trizol(Invitrogen)，RNA Later液(Ambion)，逆轉錄試劑盒(A3500，Promega)，PCR 試劑盒 (DRR041A，TAKARA)，白細胞介素 17(interleukin－17，IL－17)ELISA 試劑盒(MRK0016)，白細胞介素6(interleukin－6，IL－6)ELISA試劑盒(MRK0004)，ProteaseInhibitorCocktail(P8340，Sigma Aldrich)，DEPC(Sigma Aldrich)，10% 水合氯醛［0.035mL/(kg體重)·次］，10%中性福爾馬林緩沖液。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器:A4級栓線(北京沙東生物有限公司)，7000實時熒光定量 PCR儀(ABI，美國)，高速冷凍離心機(德國)，酶標儀，恒溫箱，冷藏冷凍箱等。

1.2 方法

1.2.1 大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)和 LIP模型

采用改良的 Longa［4］線栓法制備大鼠右側MCAO模型，即分離大鼠右側頸總動脈和頸內動脈，結扎頸總動脈近心端，同時用無菌線栓栓塞其頸內動脈約18mm。將動物分為實驗組、缺血組和假手術對照組，實驗組和缺血組均設立5個時間點:6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，每個時間點6只。實驗組采用LIP使肢體右側股動脈缺血6 min/再灌注6 min 3個循環(huán)，24 h后建立MCAO模型。缺血組僅將右側股動脈暴露相同時間，24 h后行MCAO。兩組的假手術對照組僅暴露相同部位的解剖結構，但不進行頸部線栓或肢端股動脈夾閉，每組6只。對照組于術后即刻、實驗組和缺血組于術后缺血對應時間點給予水合氯醛麻醉斷顱取腦，用于蘇木素－伊紅(hematoxylin and eosin，H＆E)染色、實時熒光定量PCR 技術(real－time quantitative PCR，QRT－PCR)和酶聯免疫吸附法 (enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)檢測主要炎癥因子的表達。

1.2.2 HE染色

取實驗組、缺血組和對照組腦組織的石蠟切片，丙酮固定1～2 min后蒸餾水洗，再逐次經過蘇木素染色5～10 min，1%鹽酸乙醇分化30s，5%淡氨水返藍2 min，伊紅乙醇浸染3 min，以上各步操作后均經過水洗。脫水透明封片后在光鏡下觀察腦組織的病理學改變。

1.2.3 QRT－PCR

按照Trizol試劑盒提供的方法提取每組腦組織細胞總 RNA，每個樣品加入1mL Trizol后研磨，經氯仿、異丙醇和乙醇純化后的 RNA用 DEPC水溶解。分別取1 uLRNA和隨機引物，用反轉錄試劑盒(20 uL體系)反轉錄成 cDNA。取2 uL cDNA用SYBR GREEN PCR試劑盒(50 uL體系)，按照兩步法PCR擴增標準程序在ABI prism 7000 Sequence Detection System上擴增，首先50℃反應10 s;階段1是預變性階段，95℃反應30 s，1個循環(huán);階段2是PCR 反應階段，95℃ 反應5 s，然后60℃ 反應31 s，重復40個循環(huán)。引物按照Genebank所提供的基因序列采用Primer－5程序設計引物后由上海生工公司合成:

得到的 CT 值通過 2－ΔΔCT公式計算不同組中 IL－17和 IL－6的相對表達量。

1.2.4 ELISA

所有腦組織經勻漿后離心取上清按照ELISA試劑盒的說明書進行操作。利用標準品建立 IL－17和IL－6的標準曲線，酶標板中加入待測樣品后在37℃孵育120 min;對應的加第一抗體工作液后在37℃孵育60 min;加酶標抗體工作液后在37℃孵育30 min;以上各步操作后酶標板均經過充分洗滌6次。加底物工作液后37℃暗處孵育15 min;加終止液后30 min內用酶標儀在450 nm處測量吸光值。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS(13.0版)統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。所有數據均用均數士標準差(±s)的形式表示。計量資料的組間統(tǒng)計學差異采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有非常顯著性差異。

圖2 缺血組和實驗組不同時間點腦組織中IL－17和IL－6 mRNA的表達水平(±s)Fig.2 IL－17 and IL－6 mRNA expressions of the cortex in ischemic group and experimental group after ischemia at different time points(±s)

2 結果

2.1 病理學改變

肉眼觀察缺血組大鼠缺血側腦半球明顯腫脹，實驗組較缺血組腫脹程度略有減輕，對照組腦組織形態(tài)均正常。光鏡下觀察HE染色的腦組織切片，對照組均未見明顯病理改變(彩插1圖1A，G)。缺血組梗死灶位于右側額頂背外側皮質和紋狀體等區(qū)域，呈片狀分布，病理改變最明顯:缺血組在缺血6 h及12 h后，可見皮層和基底核外側區(qū)腦組織呈現明顯水腫、血管周圍腔隙增寬(彩插1圖1B，C);缺血24 h及48 h后可見皮質和基底核區(qū)液化壞死灶和液化空泡增多、組織間隙嚴重水腫，同時伴有大量炎性細胞浸潤、神經細胞數量明顯減少(彩插1圖1D，E);缺血72 h后可見海馬區(qū)損傷嚴重，神經細胞喪失正常結構、呈現細胞脫失、層次減少等表型(彩插1圖1F)。相比，實驗組在相應時間點較缺血組腦實質內的壞死灶數量有下降趨勢，梗死灶周圍固縮濃染的細胞數量明顯減少，間隙水腫程度也明顯減輕(彩插1圖1H－L)，提示LIP預處理可以明顯減輕缺血引起的腦組織損傷。

2.2 QRT-PCR檢測不同時間點缺血組、實驗組腦組織中炎癥因子的表達

從圖2看出實驗組和缺血組相比，IL－17和IL－6的整體水平呈下降趨勢。實驗組中12 h、24 h和48 h腦組織中 IL－17的表達明顯低于缺血組(P＜0.05)，其中 12 h和 24 h中 IL－17的降低更明顯。實驗組中12 h、24 h和48 h腦組織中IL－6的表達顯著低于缺血組(P ＜0.01)。而 IL－17、IL－6 在 6 h 和72 h點均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

2.3 ELISA檢測不同時間點缺血組、實驗組腦組織炎癥因子的表達

從圖3看出缺血組和實驗組的 IL－17和 IL－6的表達量在12 h、24 h、48 h和72 h均明顯高于對照組。實驗組和缺血組相比，IL－17和 IL－6的表達在整體水平都有所降低。實驗組中IL－17的表達量在12 h、24 h和 48 h明顯低于缺血組(P＜0.05)，而IL－6的表達量僅在24h和48h顯著低于缺血組(P＜0.05)。

圖3 對照組、缺血組和實驗組不同時間點腦組織中IL－17和IL－6蛋白的表達水平(±s)Fig.3 IL－17 and IL－6 protein levels of the cortex in control group，ischemic group and experimental group after ischemia at different time points(±s)

3 討論

缺血性腦損傷是神經系統(tǒng)常見病和多發(fā)病，其致殘率和致死率均較高［5］，引起眾多學者的關注以尋求治療的新方法。1990年 Kitagawa［6］等發(fā)現全腦一次短暫缺血即缺血預處理并未引起明顯的腦神經損傷，且對再次致死性缺血損傷產生了明顯的保護作用，這種保護作用即為 IT，這一現象立即引起了廣泛關注。隨著研究的進展，發(fā)現通過其它方法如:輕度低氧［7］、低溫、高壓氧和肢端缺血等也可以誘導腦IT，雖其確切機制仍不清楚，但炎癥、細胞因子及凋亡的上調被認為在缺血導致的腦損傷中起重要作用［8］，目前推測非致死性預處理誘導的腦缺血耐受通過減輕上述反應而減少損傷，然而缺血預處理對某些細胞因子表達的具體效應尚不清楚。因此，本實驗將在LIP模型上研究缺血預處理對腦缺血后炎癥反應的影響。

IL－17作為一種新近發(fā)現的致炎性細胞因子，能夠誘導多種細胞分泌IL－6、IL－8、單核細胞趨化蛋白－1和細胞間黏附分子1等炎性介質［9］。IL－6是一種多效的細胞因子，是全身炎癥反應和免疫反應的重要調節(jié)因子。幾乎所有的自身免疫性疾病、炎性疾病、外傷和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，都有 IL－6和IL－17的參與［10－12］。而星形膠質細胞是中樞損傷和炎癥情況下中樞神經系統(tǒng)最主要的 IL－6的來源，IL－6不僅可以促進Th17的分化，還是IL－17重要的靶基因之一，且星形膠質細胞內也存在IL－6正反饋調控通路［13］。現在越來越多的研究報道了IL－17在腦組織中的表達，提示 IL－17可能在腦缺血的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮某種作用。有結果表明在動物MCAO模型中，IL－17在腦缺血后1h就輕度增高，在缺血后第 6 d 達高峰［14］。Li等［15］采用原位雜交和免疫組化方法檢測大鼠腦缺血后 IL－17在腦中的表達，發(fā)現IL－17在腦缺血后腦內表達從第1h到第6天逐漸增加，同時伴T細胞浸潤，并且與腦損傷面積呈正相關，表明IL－17和 T細胞參與腦損傷過程。本實驗中缺血組結果與上述結果相似，表明 IL－17在缺血后6h即有表達，隨著缺血時間的延長至24h逐漸增多，尤其是在12 h至24 h表達增多的更明顯，隨后逐漸降低;IL－6表達的規(guī)律與IL－17基本相似，證實了IL－17及IL－6參與大鼠腦組織缺血后的損傷過程，介導相關的炎癥連鎖反應。

本研究發(fā)現LIP能夠誘導腦組織 IT，從而減輕腦部的炎癥反應，而IT對其后腦缺血起到明顯的保護作用也許與IL－17和IL－6的表達減少有關。因此本實驗采用QRT－PCR和ELISA兩種方法從基因和蛋白層面來檢測 IL－17及 IL－6表達量的變化。mRNA水平顯示 IL－17及 IL－6的表達均隨缺血時間的延長而增多，在24h達到高峰后逐漸降低，而IL－6的增多更加顯著;實驗組和缺血組與對照組相比IL－17及 IL－6的表達量均增加;實驗組與缺血組相比IL－17 及 IL－6 在 12 h、24 h 和 48 h 的表達量均明顯減少。蛋白水平表明實驗組與缺血組相比，IL－17在缺血后12 h、24 h和48 h的表達量有所減少且差異具有顯著性，而IL－6蛋白表達的減少在缺血后24 h和48 h更為明顯。本實驗缺血后 IL－17和 IL－6的表達均有不同程度的增加，提示炎癥因子表達的增多加重神經系統(tǒng)的損害，從而加重缺血局部的炎癥反應。LIP后IL－17及IL－6的表達有所減少，提示缺血耐受激活了內源性保護機制使IL－17以及其誘導的其他因子如 IL－6的表達相應減少，從而使 IL－6等對腦組織的損傷作用減輕，也表明 IL－17參與腦缺血損傷的同時也通過改變其他因素間接發(fā)揮了生物學效應。

總之，本研究證實了LIP能夠誘導腦組織產生IT，通過減輕炎癥反應介導的腦損傷程度從而對腦缺血有保護作用。腦 IT使 IL－17及 IL－6的表達均減少，提示IL－17及 IL－6可能在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。因此，尋找新方法抑制 IL－17的表達或阻斷信號通路控制 IL－17的表達，減少其誘導的其他因子如IL－6從而達到減輕缺血后腦損傷的目的，可能會成為理論研究的新方向。

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The Effects of Limb Ischemic Preconditioning Pretreatment on the Inflammatory Response Induced by Cerebral Ischemia in Rats

YU Xin－di，WANG Zhen－yu，DING Lei，MO Xi，ZHU De－ming，WANG Wei
(Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，Shanghai Children＇s Medical Center，Shanghai Jiao Tong University，School of Medicine，Shanghai 200127，China)

Objective To investigate whether limb ischemic preconditioning(LIP)pretreatment has protective effects to the brain after cerebral ischemic injury by investigating the effects of LIP pretreatment on anti－inflammatory response in rats.Methods Seventy－two Sprague Dawley rats were divided into 3 groups:experimental group(n=30)，ischemic group(n=30)and control group(n=12).Six samples from five timepoints(6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after surgical manipulation)were collected for the experimental and ischemic groups，while other twelve animals were untreated and used as controls.The models with middle cerebral artery occlusion(MCAO)were obtained by thread blocking and the models with cerebral ischemic tolerance(IT)were obtained by LIP pretreatment.The determination of histopathological changes，real－time quantitative PCR(QTR－PCR)and enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)were used to observe the expression of interleukin－17(IL－17)and interleukin－6(IL－6).Results The pathological change in experimental group was not as obvious as ischemia group.The results of QRT－PCR demonstrated that the expression of IL－17 and IL－6 were reduced significantly in experimental group.Significant different in the expression of IL－17 and IL－6 were found between ischemia and experimental groups at 12 h、24 h and 48 h time points(P ＜ 0.01).The data of ELISA suggested that the expression of IL－17 and IL－6 were reduced obviously in experimental group.Significant different in the expression of IL－17 were found between ischemia and experimental groups at 12 h、24 h and 48h time points(P ＜ 0.05)，while significant different in the expression of IL－6 were at 24 h and 48 h time points(P ＜ 0.05).Conclusion LIP pretreatment could induce ischemic tolerance，probably by providing obviously anti－inflammatory effects and protective function for the followed ischemic injury.

Inflammatory response;Cerebral injury;Limb ischemic preconditioning;Ischemic tolerance

R332

A

1671－7856(2012)09－0008－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.001.002

2012－07－25

圖1 缺血組和實驗組不同時間點的腦組織切片HE染色（×100）
Fig.1 HE staining of brain tissues from ischemic group and experimental group after ischemia at different time points （×100）

上海市科委項目資助(09411965200)。

于新迪，女(1985－)，住院醫(yī)師，研究生，研究方向:先心病圍術期臟器功能的保護。

王偉，Email:wangweicpb@gmail.com。