張星東

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型在致敏、哮喘發(fā)作和氣道高反應(yīng)性等方面的應(yīng)用研究

張星東

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

過(guò)敏性哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。使用了幾十年的主要治療藥物腎上腺糖皮質(zhì)激素副作用較大，因此發(fā)現(xiàn)好的預(yù)防和治療方法成為迫切要解決的問(wèn)題。動(dòng)物模型是研究人類疾病的重要手段，但不少疑難病的發(fā)病機(jī)理不明確，因而制備的動(dòng)物模型和人類疾病的相似度有差異。但Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)作為過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)理是比較明確的，據(jù)此制備的動(dòng)物模型和人類的哮喘就有很高的相近度，結(jié)果的可信度就較高。本文回顧了哮喘動(dòng)物模型制備的基本方法和某些重要的細(xì)節(jié)。著重討論了當(dāng)今最常用的氣道高反應(yīng)性模型的優(yōu)劣。如果綜合運(yùn)用不同特點(diǎn)的模型尤其是能觀察記錄哮喘發(fā)作全過(guò)程包括速發(fā)和遲發(fā)反應(yīng)的模型，將可以更直接地探索哮喘發(fā)病過(guò)程和治療藥物。對(duì)氣道重塑及基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物模型中的研究和使用也做了一般性論述。動(dòng)物模型將是一個(gè)有力的工具為最后有效地預(yù)防和治療過(guò)敏性哮喘找到突破口。

模型，動(dòng)物;過(guò)敏;變態(tài)反應(yīng);哮喘;致敏;氣道激發(fā);氣道高反應(yīng)性

過(guò)敏性哮喘是國(guó)際范圍內(nèi)的重要疾病之一，給患者的生活造成了極大的影響。發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)。根據(jù)聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織的估算，世界范圍內(nèi)哮喘患者達(dá)三億之多，很少有這樣一種病以這樣高的發(fā)病率發(fā)生在各個(gè)國(guó)家，波及到各個(gè)層次包括不同年齡或不同經(jīng)濟(jì)狀況的人群中，缺乏理想的治療手段［1］。幾十年來(lái)腎上腺糖皮質(zhì)激素仍然是比較有效的治療和預(yù)防過(guò)敏性哮喘發(fā)作的藥物，但其較大的副作用同時(shí)也限制了臨床的應(yīng)用。因此深入研究發(fā)病過(guò)程發(fā)現(xiàn)有效的預(yù)防和治療方法成為當(dāng)今要迫切解決的問(wèn)題。

動(dòng)物模型可以對(duì)于人類自身疾病的研究提供很有益的幫助。遺憾的是很多重要的疑難病如原發(fā)性高血壓、紅斑性狼瘡等，因?yàn)椴∫蚝桶l(fā)病機(jī)制不甚明了，因此這類動(dòng)物模型和人類同名疾病在多大程度上相類似是不清楚的。幸運(yùn)的是，與很多其他一些疑難病相比，過(guò)敏性哮喘的病因和發(fā)病機(jī)制相對(duì)清楚，即外部抗原進(jìn)入機(jī)體后引起的I型變態(tài)反應(yīng)。因此，根據(jù)外來(lái)抗原進(jìn)入機(jī)體導(dǎo)致I型變態(tài)反應(yīng)這個(gè)基本原理而制備的動(dòng)物模型可能更貼近人類的過(guò)敏性哮喘，也就更有可能去認(rèn)識(shí)該病的發(fā)病機(jī)制。近二、三十年的研究也正是主要借助動(dòng)物模型在發(fā)病的細(xì)節(jié)方面對(duì)該病了解的更深入了，取得了很多的進(jìn)展，使我們對(duì)該病的認(rèn)識(shí)大大提高了。我們知道了特異性IgE的產(chǎn)生是Th2途徑，細(xì)胞因子，轉(zhuǎn)錄因子。本文擬根據(jù)該病的基本發(fā)生過(guò)程來(lái)綜述和探討目前利用動(dòng)物模型研究過(guò)敏性哮喘的歷史、現(xiàn)狀和展望。

致敏過(guò)程 (sensitization)

致敏即將抗原采用某種方式導(dǎo)入體內(nèi)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)和處理，最后由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)此種抗原的特異性抗體并結(jié)合到肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞表面受體的過(guò)程。

抗原是多種多樣的，理論上說(shuō)凡是可以導(dǎo)致過(guò)敏性哮喘的蛋白或小分子化合物半抗原等都可用于動(dòng)物模型研究。除了實(shí)驗(yàn)中最常用的卵蛋白(ovalbumin)，其他可能接觸到的如生活環(huán)境中花粉、塵螨、霉菌、動(dòng)物皮屑;生產(chǎn)環(huán)境中的糧食、化工產(chǎn)品如有機(jī)酸酐、異氰酸酯類化合物、農(nóng)藥、蛋白酶、動(dòng)物皮屑及排泄物、乳膠等，都可用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究［2，3，4］。

抗原導(dǎo)入體內(nèi)的方式可以是注射，也可以是氣道吸入。某些抗原也可經(jīng)皮膚接觸而進(jìn)入體內(nèi)。免疫佐劑(adjuvant)的使用是為了非特異地刺激免疫系統(tǒng)以增加特異性抗體的產(chǎn)生，但佐劑并不是抗原在致敏動(dòng)物時(shí)必需要用的。

(1)蛋白類抗原

例如卵蛋白的使用方法目前最常用的是腹腔注射，也可以霧化吸入。因?yàn)榈鞍资侨乖?，比較容易致敏。

(2)半抗原

半抗原用于致敏動(dòng)物時(shí)是需要掌握基本技術(shù)和基礎(chǔ)知識(shí)的。半抗原一般為小分子化合物，自身不能被免疫系統(tǒng)識(shí)別來(lái)啟動(dòng)致敏過(guò)程。以有機(jī)酸酐為例，這是一組化合物包括鄰苯二甲酸酐(phthalic anhydride，簡(jiǎn)稱苯酐或 PA)、偏苯三酸酐(trimellitic anhydride，簡(jiǎn)稱 TMA)、六氫鄰苯二甲酸酐(cis－h(huán)exahydrophthalic anhydride)等，基本結(jié)構(gòu)是由6碳環(huán)和兩個(gè)羧基去掉一個(gè)水分子形成，是化工生產(chǎn)中重要的原料。工作人員在生產(chǎn)環(huán)境中反復(fù)接觸了某種酸酐后可能出現(xiàn)哮喘發(fā)病，引起國(guó)際上中、美、英、德、意、日等國(guó)家的重視。近年的研究基本認(rèn)定酸酐是作為半抗原進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE而引起哮喘，屬于I型變態(tài)反應(yīng)。在探討酸酐哮喘的發(fā)病機(jī)制過(guò)程中，大量使用了動(dòng)物模型，為我們提供了很多有益的啟示。

抗原是經(jīng)過(guò)何種途徑進(jìn)入機(jī)體的?通常認(rèn)為，比較有可能的是經(jīng)呼吸道吸入后和免疫系統(tǒng)接觸。是否有其他可能例如皮膚粘膜也作為一種途徑將抗原導(dǎo)入體內(nèi)?研究人員在給動(dòng)物用抗原致敏的時(shí)候，一方面是不管抗原天然進(jìn)入體內(nèi)的方式，一律采取注射的方式將抗原導(dǎo)入體內(nèi)，另一種方式是意圖模擬自然條件下抗原進(jìn)入機(jī)體的方式來(lái)制備動(dòng)物模型進(jìn)而為預(yù)防抗原進(jìn)入機(jī)體內(nèi)引起致敏的發(fā)生提供預(yù)防措施。

利用吸入的方法制備動(dòng)物模型:早期的學(xué)者是給豚鼠吸入半抗原(異氰酸酯類)，致敏成功即測(cè)出特異性抗體后，用全抗原即結(jié)合了蛋白形成復(fù)合物的溶液霧化吸入來(lái)激發(fā)哮喘［5］。但也有學(xué)者用酸酐氣溶膠干粉(TMA)給豚鼠吸入，致敏成功測(cè)出了抗體，但沒(méi)能用全抗原成功激發(fā)出哮喘［6］。近年的研究證實(shí)，用TMA半抗原氣溶膠干粉給挪威褐鼠吸入致敏成功，然后仍用同樣的TMA半抗原氣溶膠給動(dòng)物吸入激發(fā)也成功地導(dǎo)致了哮喘發(fā)作［7］。

利用非吸入的方法制備動(dòng)物模型:早期(廿世紀(jì)七、八十年代)研究人員在用酸酐致敏動(dòng)物時(shí)是將酸酐加入蛋白溶液中反應(yīng)形成酸酐蛋白結(jié)合物(conjugate)，即得到酸酐的全抗原，然后給動(dòng)物注射，動(dòng)物產(chǎn)生了特異的 IgE，致敏成功［8］。但這和人在生產(chǎn)環(huán)境中接觸酸酐的方式是不同的，人接觸的是半抗原形式的酸酐，進(jìn)入體內(nèi)以后和體內(nèi)的蛋白結(jié)合形成全抗原。

到上世紀(jì)80年代末90年代，研究人員發(fā)現(xiàn)用多種有機(jī)酸酐以半抗原的形式和植物油或液體石蠟配制成懸浮液給豚鼠或挪威褐鼠皮內(nèi)注射也可產(chǎn)生特異的抗體使動(dòng)物致敏并激發(fā)哮喘［9－12］。這個(gè)方法的成功使得研究人員知道僅僅用半抗原也是可以用注射的方式使動(dòng)物致敏的。說(shuō)明半抗原在皮膚內(nèi)與機(jī)體的某種蛋白結(jié)合形成了全抗原。研究還發(fā)現(xiàn)皮下注射的效果不如皮內(nèi)注射，皮內(nèi)注射可以產(chǎn)生更高滴度的特異性抗體。這種差異的產(chǎn)生推測(cè)是因?yàn)槠は潞懈嗟闹?，而皮?nèi)含有更多比例的蛋白，血液循環(huán)豐富，淋巴管盲端的開口也位于皮內(nèi)，這些條件利于半抗原和蛋白結(jié)合并經(jīng)血液和淋巴管運(yùn)輸和免疫細(xì)胞接觸產(chǎn)生反應(yīng)。

在上述工作的基礎(chǔ)上，研究人員 Zhang，Siegel等試驗(yàn)將有機(jī)酸酐TMA的干粉直接放置在麻醉的挪威褐鼠的背部皮膚上，4 h后用水洗掉。這種非創(chuàng)傷性的實(shí)驗(yàn)方法也獲得成功，動(dòng)物產(chǎn)生的抗體滴度和背部皮膚使用的抗原 TMA劑量正相關(guān)［13］。致敏的動(dòng)物用TMA干粉吸入激發(fā)出現(xiàn)了哮喘發(fā)作［14］。這個(gè)研究的成功說(shuō)明抗原進(jìn)入機(jī)體不僅僅限于呼吸道的吸入，即使正常完整的皮膚也可被某些抗原穿過(guò)進(jìn)入體內(nèi)產(chǎn)生致敏進(jìn)而在吸入抗原時(shí)發(fā)生哮喘。這個(gè)研究的意義是重大的，給生產(chǎn)者、醫(yī)務(wù)人員和政府決策部門提供了這樣的信息:預(yù)防哮喘尤其是職業(yè)相關(guān)的哮喘甚至其他和化合物接觸所患疾病的防護(hù)政策時(shí)，僅僅呼吸道的防護(hù)是不夠的，皮膚粘膜等的全身性防護(hù)也是必要的。

通過(guò)模擬實(shí)際生活中人自然接觸半抗原而致敏的方式，即吸入或皮膚直接接觸有機(jī)酸酐半抗原致敏動(dòng)物并成功用半抗原激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生哮喘，都說(shuō)明半抗原進(jìn)入機(jī)體后可自行與體內(nèi)的蛋白結(jié)合形成全抗原而啟動(dòng)致敏過(guò)程。需要指出的是，酸酐遇水形成酸則不能和蛋白結(jié)合而失去過(guò)敏原的效能［13，15］。因此體外配制酸酐類半抗原試劑只能用不含水的液體如油或液體石蠟，若配置全抗原試劑必須用事先溶有蛋白的水溶液，不可以先將酸酐加入水中以后再加蛋白。

致敏過(guò)程是哮喘發(fā)生前期的一個(gè)很重要的步驟。對(duì)抗原種類和性能的了解，對(duì)于致敏過(guò)程形成機(jī)制的研究，有助于預(yù)防致敏的發(fā)生，對(duì)哮喘的預(yù)防可起到未雨綢繆的作用。自然條件下抗原進(jìn)入機(jī)體后并不是所有的人都會(huì)出現(xiàn)Th2型免疫反應(yīng)。正常情況下，呼吸道粘膜中的樹突細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)控對(duì)吸入的抗原的反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)性(regulatory)T細(xì)胞抑制Th2型記憶淋巴細(xì)胞的激活，從而終止特異性IgE的合成，這種免疫耐受是一種對(duì)外來(lái)抗原入侵的保護(hù)性免疫［16］。如果能從動(dòng)物模型的角度研究這種保護(hù)性免疫現(xiàn)象的機(jī)制，就會(huì)對(duì)哮喘的預(yù)防從致敏的層次水平加以阻斷。目前治療哮喘的思路主要集中在哮喘發(fā)生后的藥物控制和脫敏，從致敏階段著手研究也是很有意義的途徑。

特異性氣道激發(fā)(airway challenge)

也稱支氣管激發(fā)試驗(yàn)(bronchial provocation test－BPT)，即給抗原致敏的動(dòng)物再吸入同樣抗原模擬或展示哮喘發(fā)作的過(guò)程。哮喘發(fā)作主要表現(xiàn)在氣道阻力的增加。因此在觀測(cè)動(dòng)物的哮喘發(fā)作時(shí)除了觀察癥狀，更重要的是記錄氣道阻力的變化。經(jīng)典的較常用的測(cè)量氣道阻力的一種方法是應(yīng)用或部分應(yīng)用吸氣末阻斷法(end－inspiratory airway occlusion method)來(lái)進(jìn)行的［17－19］?；驹硎菍?dòng)物深度麻醉使之失去自主呼吸而經(jīng)氣管插管由呼吸機(jī)代替。氣道平滑肌中有肺牽張反射的感受器，在吸氣末阻斷氣流，使氣道壓維持在平臺(tái)壓從而抑制肺牽張反射，這樣測(cè)出的壓力反映了呼吸系統(tǒng)彈性回縮壓，測(cè)定的數(shù)值直接而準(zhǔn)確，被用于哮喘發(fā)作的研究［20，21］。Johnson等也建立了一套氣流阻斷技術(shù)(flow－interruption technique)即用吸氣末和呼氣末阻斷測(cè)量的數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定氣道阻力的方法［22，23］。這類方法均由于動(dòng)物處于深度麻醉狀態(tài)，各種正常的生理反應(yīng)發(fā)生變化，一般在氣道激發(fā)后只能觀察較短的時(shí)間，例如用于觀察哮喘的速發(fā)反應(yīng) (圖1)。

上述方法如果要連續(xù)觀察數(shù)小時(shí)、十幾小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間的哮喘發(fā)作的整個(gè)自然過(guò)程包括速發(fā)和遲發(fā)反應(yīng)直至消退，進(jìn)而研究發(fā)病機(jī)制和對(duì)藥物的治療反應(yīng)就不是理想的方法了。

臨床上一般出于診斷的目的對(duì)某些患者也要在有急救準(zhǔn)備的條件下吸入特異性抗原做支氣管激發(fā)試驗(yàn)，在清醒狀態(tài)下定期測(cè)定肺功能24h后分析發(fā)現(xiàn)人類經(jīng)典的哮喘發(fā)作包括速發(fā)(early－phase airway response－EAR)和遲發(fā)(late－phaseairway response－LAR)雙相反應(yīng)(biphasic asthmatic response)。速發(fā)反應(yīng)在吸入抗原后數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)，約一個(gè)小時(shí)內(nèi)消退。再過(guò)一個(gè)小時(shí)之后漸漸出現(xiàn)遲發(fā)反應(yīng)，一般可以持續(xù)數(shù)小時(shí)、十幾小時(shí)甚至更長(zhǎng)［24－26］。

圖1 用氣道阻力指標(biāo)觀察豚鼠哮喘發(fā)作速發(fā)反應(yīng)階段。橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為氣道阻力的數(shù)值。

據(jù)此，能夠制備成像人類這樣出現(xiàn)速發(fā)和遲發(fā)雙向哮喘反應(yīng)的動(dòng)物模型是評(píng)定模型質(zhì)量的重要指標(biāo)。推測(cè)某些動(dòng)物也會(huì)像人那樣在哮喘發(fā)作后出現(xiàn)雙相反應(yīng)，關(guān)鍵是如何連續(xù)動(dòng)態(tài)地記錄下來(lái)。深度麻醉的動(dòng)物反應(yīng)性不好，也不適合進(jìn)行數(shù)小時(shí)甚至更長(zhǎng)的連續(xù)實(shí)驗(yàn)，一般只是在激發(fā)后記錄1小時(shí)以內(nèi)的數(shù)據(jù)，相當(dāng)于哮喘發(fā)作的速發(fā)階段。有學(xué)者用大動(dòng)物羊在頭部仰位固定、局部麻醉下將球囊導(dǎo)管(balloon catheter)經(jīng)鼻孔置放在食道下端，經(jīng)另一個(gè)鼻孔將帶管頭的氣管內(nèi)導(dǎo)管(cuffed endotracheal tube)插入氣管。這樣通過(guò)跨肺壓和氣流即可計(jì)算直接得到氣道阻力并記錄到了遲發(fā)反應(yīng)［27］。從文獻(xiàn)記錄的情況看，實(shí)驗(yàn)人員在激發(fā)后每隔一小時(shí)記一次數(shù)據(jù)，可以記錄24 h以上。動(dòng)物處于強(qiáng)制體位，故而推測(cè)是每次記錄完畢需要將食道和氣管里的導(dǎo)管取出，給羊解除固定，令動(dòng)物休息進(jìn)食等。然后再次固定、局麻、插管。這種方法有其優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)例如每隔一小時(shí)記錄一次可能會(huì)錯(cuò)過(guò)很多有用的數(shù)據(jù);同時(shí)操作復(fù)雜;動(dòng)物較大，因此樣本的數(shù)量受限制。

1997年，Hamelmann等報(bào)告了一種新的氣壓全身體積描記法(whole body plethysmography)用于記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠呼吸道反應(yīng)［28］。和此前經(jīng)典方法不同的是動(dòng)物一直處于清醒狀態(tài)，無(wú)創(chuàng)傷性操作，動(dòng)物在透明有機(jī)玻璃制成的容器內(nèi)，有進(jìn)出空氣的管道，可隨意進(jìn)食飲水。經(jīng)傳感器測(cè)量氣壓的變化來(lái)計(jì)算得出間接反映氣道阻力變化的數(shù)據(jù)稱為enhanced pause(Penh)。經(jīng)比較，Penh的增加和經(jīng)典方法得來(lái)的氣道阻力增加有很好的相關(guān)性。由于這種方法可以長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)、連續(xù)記錄，為研究觀察哮喘發(fā)作速發(fā)和遲發(fā)全過(guò)程提供了可能。

2004年，Zhang等首次發(fā)表了用上述全身體積描記法成功記錄到了哮喘速發(fā)和遲發(fā)全過(guò)程的報(bào)告(圖2)。該實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為大鼠，用偏苯酸酐經(jīng)皮膚直接接觸致敏，直接吸入該酸酐的干粉激發(fā)10 min后每30 s錄一次數(shù)據(jù)，觀察到動(dòng)物立即出現(xiàn)哮喘速發(fā)反應(yīng)，持續(xù)約數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘，一小時(shí)內(nèi)消退。約兩小時(shí)后漸漸出現(xiàn)遲發(fā)反應(yīng)，達(dá)到峰值后再漸漸消退。遲發(fā)反應(yīng)相時(shí)間較長(zhǎng)，從3、4h到十幾小時(shí)不等，反映氣道阻力的Penh的峰值也較速發(fā)反應(yīng)相的峰值更高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)哮喘是否發(fā)作、是僅僅出現(xiàn)速發(fā)相還是速發(fā)相遲發(fā)相都出現(xiàn)是和激發(fā)哮喘時(shí)所用的抗原濃度有關(guān)的［14］。

圖2 用Penh指標(biāo)觀察挪威褐鼠哮喘發(fā)作速發(fā)和遲發(fā)反應(yīng)全過(guò)程。圓形為致敏組，三角形為非致敏組。

氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness)

即非特異性氣道激發(fā)試驗(yàn)得出的結(jié)果。近30年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性哮喘在發(fā)作之后氣道在形態(tài)和功能上仍沒(méi)有恢復(fù)正常，表現(xiàn)為一種炎癥過(guò)程，因此就有了一種較普遍的認(rèn)識(shí)即把哮喘看成一種慢性炎癥性疾病。對(duì)這種炎癥進(jìn)行的氣道敏感性試驗(yàn)或者說(shuō)是非特異性的氣道激發(fā)試驗(yàn)，如果陽(yáng)性，就稱其為氣道高反應(yīng)性，炎癥經(jīng)治療后高反應(yīng)性也隨之降低［29，30］。這被認(rèn)為是診斷哮喘的重要指標(biāo)，是哮喘研究歷史上一種里程碑性的進(jìn)步［31］。氣道高反應(yīng)性發(fā)生的機(jī)制還不是很清楚［29］。檢驗(yàn)這種高反應(yīng)性的方法目前最多用的是乙酰膽堿試驗(yàn)(methocholine test)，廣泛用于人，也在動(dòng)物模型上用的很多?；驹砭褪怯貌煌瑵舛鹊囊阴＜啄憠A吸入后觀察氣道的反應(yīng)。如果某一濃度對(duì)正常氣道沒(méi)有作用，但卻可以使已經(jīng)有了炎癥的氣道出現(xiàn)反應(yīng)(阻力增加)，這就是氣道高反應(yīng)性試驗(yàn)陽(yáng)性。氣道高反應(yīng)性的出現(xiàn)實(shí)質(zhì)上被認(rèn)為僅僅代表氣道有炎癥，不是過(guò)敏性哮喘特有的，陽(yáng)性雖有助于診斷哮喘但不能確定一定是哮喘;陰性也不能排除哮喘［32，33］。也不能用此試驗(yàn)取代對(duì)哮喘遲發(fā)反應(yīng)相的觀察，后者是哮喘發(fā)作的一個(gè)特有的過(guò)程。氣道高反應(yīng)很重要是因?yàn)楹芏嘞颊叨汲赎?yáng)性，但只有參考意義，要正確認(rèn)識(shí)哮喘和炎癥的關(guān)系，避免把哮喘等同于炎癥而使研究偏離方向。目前在研究領(lǐng)域小鼠模型是用的較多的，而且很多是用小鼠做乙酰膽堿試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證藥物作用或某些靶點(diǎn)阻斷后的效果，研究者應(yīng)該明確這是在觀察對(duì)炎癥的影響，可能和哮喘本身有關(guān)，也可能無(wú)關(guān)。

氣道重塑(airway remodeling)

也稱氣道重構(gòu)或氣道重建，過(guò)敏性哮喘從臨床的角度看是一種以發(fā)作性、可逆性支氣管痙攣為特征的疾病。從病理學(xué)的角度看，是粘膜層和粘膜下層的炎癥性變化。上皮細(xì)胞剝離，支氣管粘膜水腫，上皮層中的杯狀細(xì)胞肥大增生，粘液腺增生，平滑肌細(xì)胞肥大、增生。內(nèi)有嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。針對(duì)這種炎癥，機(jī)體在自身修復(fù)的過(guò)程中發(fā)生了氣道的重新構(gòu)建，其本身是一種機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制。但重塑可能出現(xiàn)三種變化又影響了正常的肺功能:氣道彈性降低、平滑肌細(xì)胞的肥大增生使得哮喘發(fā)作平滑肌收縮更加重了氣道狹窄以及膠原在基底膜下的沉積導(dǎo)致的氣道壁增厚［34，35］。早期糖皮質(zhì)激素抗炎治療可能有助于防止再構(gòu)建，而支氣管擴(kuò)張劑類的藥物對(duì)重組的效果還沒(méi)有定論［34］。目前對(duì)于氣道重塑的理解很多是過(guò)去十幾年通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)現(xiàn)的。例如實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在成年動(dòng)物即使抗原刺激停止后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)上皮下的纖維化以及嗜酸細(xì)胞仍持續(xù)發(fā)生［36］。目前的研究熱點(diǎn)之一是上皮細(xì)胞和哮喘的關(guān)系，因此人們也開始關(guān)注上皮細(xì)胞和氣道重塑的關(guān)系，動(dòng)物模型也必將在這個(gè)領(lǐng)域?yàn)槲覀兊难芯刻峁┍憷?7］。

基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)(geneknock-out，transgenesis)

基因敲除是上世紀(jì)80年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù)。是通過(guò)一定手段使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。一般說(shuō)來(lái)，基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。

過(guò)敏性哮喘的基本發(fā)病原理早已知道，發(fā)病機(jī)制的完全闡明雖然還有很長(zhǎng)的路要走，但很多細(xì)節(jié)近年也在動(dòng)物模型的幫助下了解了很多。特異性抗體曾經(jīng)廣泛用于動(dòng)物模型來(lái)阻斷某個(gè)位點(diǎn)或靶點(diǎn)例如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、受體或抗體等來(lái)驗(yàn)證哮喘發(fā)作的必需環(huán)節(jié)例如抗 GATA－3、抗 IL－5、抗IgE等的應(yīng)用。如果使用基因敲除技術(shù)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)則可以避免應(yīng)用抗體的某些弊端，如這種抗體的特異性、反復(fù)使用可能動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生對(duì)抗此抗體的抗體等。采用這類新技術(shù)制備的動(dòng)物模型可以從不同的角度例如使某種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、抗體甚至細(xì)胞的缺失來(lái)研究觀察哮喘的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而為治療手段或藥物的開發(fā)提供方向［38－40］。

機(jī)制和治療研究

上面的討論順便提到了機(jī)制和治療的研究。這里需要重點(diǎn)闡述的是，上述動(dòng)物模型建立起來(lái)之后，可以根據(jù)需要進(jìn)行過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制和治療研究。目前國(guó)際上的很多研究主要是用氣道高反應(yīng)性的模型來(lái)進(jìn)行的［41］。這可能是由于研究手段的限制造成的一個(gè)不完善的策略。隨著手段的改進(jìn)和發(fā)展，隨著新的動(dòng)物模型的建立，正確的方法應(yīng)該是根據(jù)需要，從致敏、哮喘發(fā)作、發(fā)作后的預(yù)防治療包括脫敏等不同角度來(lái)多層次進(jìn)行。值得指出的是，除了氣道高反應(yīng)的模型用本文討論過(guò)的其他動(dòng)物模型或者將來(lái)再開發(fā)的更新的動(dòng)物模型，機(jī)制研究和治療研究必須用可以記錄整個(gè)哮喘發(fā)作過(guò)程的包括哮喘速發(fā)和遲發(fā)反應(yīng)的動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上，除了免疫學(xué)和生理學(xué)外，還要結(jié)合其他學(xué)科如藥理學(xué)、藥物學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)來(lái)發(fā)現(xiàn)有效的、副作用小的藥物或手段。

結(jié)語(yǔ)

過(guò)敏性哮喘的基本發(fā)病原理屬I型變態(tài)反應(yīng)。根據(jù)這個(gè)原則制備的動(dòng)物模型使其和別的很多疑難病相比，更可能接近人類的哮喘。因此根據(jù)這類動(dòng)物模型所取得的數(shù)據(jù)對(duì)于我們理解人類的哮喘更有啟發(fā)性。目前已經(jīng)開發(fā)成功的一些動(dòng)物模型主要有:用于觀察哮喘速發(fā)反應(yīng)相的模型(主要是麻醉動(dòng)物)、可以觀察速發(fā)和遲發(fā)雙相反應(yīng)的清醒模型(主要是清醒動(dòng)物)、用來(lái)研究哮喘炎癥過(guò)程的氣道高反應(yīng)性模型以及基因敲除模型。這些不同的動(dòng)物模型可根據(jù)需要單獨(dú)或結(jié)合使用來(lái)從不同角度探索哮喘的發(fā)病過(guò)程，使我們可以從致敏、疾病發(fā)作、發(fā)作后的進(jìn)程等環(huán)節(jié)從不同層次和深度來(lái)認(rèn)識(shí)哮喘的全過(guò)程。下一步的首要任務(wù)將是從預(yù)防和治療的角度進(jìn)行研究，利用動(dòng)物模型這個(gè)有力的工具，為最后有效地治療過(guò)敏性哮喘找到突破口。

致謝:文中很多研究經(jīng)驗(yàn)是筆者20年來(lái)自己用動(dòng)物模型研究哮喘的總結(jié)。這些工作在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部、瑞典隆德大學(xué)及哥德堡大學(xué)、美國(guó)國(guó)家科學(xué)院、美國(guó)疾病控制中心和肯塔基大學(xué)完成。其中劉鏡愉教授(北京)、Welinder教授(瑞典隆德)、Skerfving教授(瑞典隆德)、Lotval教授(瑞典哥德堡)、Siegel教授(美國(guó)科學(xué)院和疾病控制中心)、Fedan教授(美國(guó)疾病控制中心)和 Shi教授(美國(guó)肯塔基)等很多學(xué)者給予了全力培養(yǎng)和支持。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所所長(zhǎng)秦川教授盛情約稿促成本文的最后完成。

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Sensitization，Airway Challenge and Airway Hyperresponsiveness in Animal Models of Allergic Asthma

ZHANG Xing－dong
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science(CAMS)＆ Comparative Medical Center，Peking Union Medical College(PUMC))

Allergic asthma is an important disease.The interflow of asthma between animal models and human is that the former is also established on type I hypersensitivity.Sensitization is the first step for animal models of asthma.The characteristics and reactivity of complete allergens and haptens may lead to different outcomes.Airway challenge is a useful tool to study asthmatic responses.The new methods enabled successful observation of early－phase and late－phase asthmatic responses.Work on the pathogenesis and therapy of asthma should be conducted with different models besides the one of airway hyperresponsiveness used popularly nowadays.Other applications using animal models including airway remodeling，gene knock－out，transgenesis and therapeutic drugs were also reviewed briefly.

Model，animal;Allergy;Asthma;Sensitization;Airway challenge;Airway hyperresponsiveness

R332

A

1671－7856(2012)09－0001－07

10.3969/j.issn.1671.7856.2012.09.001

2012－09－05