許 琴，任秀梅，趙彥斌，胡仲明，李建瑛，孫兆增，隋麗華，劉 一，劉文森

(1.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122;2.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科，烏魯木齊 830000;3.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，長春 130062;4.軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071)

間情期與發(fā)情期比格犬子宮與卵巢組織形態(tài)學的比較

許 琴1，2，任秀梅3，趙彥斌4，胡仲明4，李建瑛2，孫兆增4，隋麗華4，劉 一4，劉文森1

(1.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122;2.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科，烏魯木齊 830000;3.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，長春 130062;4.軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071)

目的 比較比格犬的子宮、卵巢在間情期與發(fā)情期的組織形態(tài)學的差異，為后期研究奠定基礎(chǔ)。方法 用化學發(fā)光法測定了23只經(jīng)產(chǎn)比格母犬的血清性激素水平，選取經(jīng)血清學鑒定處于發(fā)情期的比格犬2只，間情期的比格犬4只的卵巢和子宮標本，中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色鏡檢，拍照。結(jié)果 間情期犬子宮及其內(nèi)膜較薄，間質(zhì)纖維增生，黃體中以初級卵泡為主，可見1～2個次級卵泡，未見成熟卵泡，卵泡和黃體細胞間纖維較多、血管少。發(fā)情期犬子宮及其內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜腺體腔較大，部分腺體呈分枝狀彎曲，腺上皮腫大，胞漿淡染，少數(shù)可見核下空泡。卵巢中卵泡數(shù)量較多，有初級、次級和1～2個成熟卵泡。黃體細胞數(shù)量多，排列規(guī)則，境界清楚，間質(zhì)纖維比較疏松，血管多，未見空泡變性。間情期和發(fā)情期犬卵巢中未見明顯白體。結(jié)論 間情期比格犬的性激素維持在一比較低的水平，在發(fā)情前期雌激素水平迅速增高，而在排卵后比格犬的孕酮水平較高。隨發(fā)情周期的變化，卵巢和子宮在形態(tài)學上發(fā)生相應的變化。

比格犬;發(fā)情期;間情期;形態(tài)學

比格犬因其性情溫順，體型適中，在國內(nèi)外一直被用作標準化的實驗動物。但隨著使用年限的延長，比格犬種群內(nèi)的不孕現(xiàn)象比較普遍，影響了比格犬的生產(chǎn)。另一方面，作為標準化的實驗動物，對比格犬體重、年齡、個體差異的均一性提出了更高的要求，因此對比格犬進行誘導發(fā)情、同期發(fā)情、超數(shù)排卵和胚胎移植很必要。但不同于豬、牛、羊，由于生殖生理的特殊性，犬卵母細胞的體外培養(yǎng)成熟率低，輔助生殖研究進展緩慢，嚴重制約了其在生物科學研究中的運用［1］。本研究室對比格犬的生殖生理進行了一定的基礎(chǔ)研究［2，3］，現(xiàn)就發(fā)情期與間情期比格犬性激素水平、卵巢與子宮組織形態(tài)學的特點進行初步研究，為后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

經(jīng)產(chǎn)比格母犬23只，18～22 kg，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號:［SCXK－(軍)2002－001］，實驗動物使用合格證號:［SYXK－(軍)2007－005］。

1.2 儀器設備

萊卡切片機(德國)，BI2000圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟)，SIEMENS Centaur－XP全自動生化分析儀(德國)，HITACHI CF 16RX 離心機(日本)。

1.3 方法

由前肢小隱靜脈采取靜脈血，室溫放置1 h后，經(jīng)3500 r/min，15 min離心，吸取血清，－70℃凍存，待檢。比格犬經(jīng)鹽酸氯胺酮麻醉后［4］，放血取卵巢，子宮組織，4%中性多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE 染色，鏡檢，拍照［5］。

血清 PRGE、E2、FSH、LH 測定:由 SIEMENS Centaur－XP全自動生化分析儀用發(fā)光法檢測。由公司提供的原裝配套試劑，按操作說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)情期犬與間情期犬的鑒定

2.1.1 外觀及行為學觀察:在生產(chǎn)中，觀察到母犬外生殖器腫大，水平直徑明顯增大，陰道出現(xiàn)血性或漿液性分泌物，變得興奮，喜歡爬跨別的母犬，飲水增多、頻尿，并試圖吸引公犬，見到公犬后腰下凹，骨盆部抬高，后軀轉(zhuǎn)向公犬，尾擺向一側(cè)露出會陰。將有這種表現(xiàn)的犬暫定為發(fā)情期犬，對沒有以上任何一種表現(xiàn)的犬歸為間情期犬。

2.1.2 比格犬血清E2、FSH、LH、PRGE的測定:對比格犬血清雌激素(E2)，促卵泡生成素(FSH)，促黃體生成素(LH)及孕酮(PRGE)的測定結(jié)果如下表:

外觀及行為學觀察結(jié)合血清學指標，最終選定2只發(fā)情期犬，4只間情期犬，按照1.3所述方法進行后續(xù)組織形態(tài)學觀察。

2.2 發(fā)情期犬與間情期犬卵巢與子宮的組織形態(tài)學觀察(封3圖1－9)

2.2.1 子宮:間情期犬(C1～C6號)其子宮肌壁厚度平均為34mm，內(nèi)膜平均厚度19.25mm，內(nèi)膜腺體均表現(xiàn)為增殖期改變，腺體小而少，絕大部分成圓形或直管道，腺上皮呈立方形，大小較一致，腺體間纖維組織多，排列緊密，血管較少，內(nèi)層肌纖維體積小，染色較深，排列緊密，血管層血管數(shù)量較少，外層肌纖維大小較一致，排列規(guī)則(圖1)。

表1 間情期、發(fā)情期、發(fā)情后期比格犬的性激素水平Tab.1 Determination of beagles sexual hormone of beagles in diestrus，estrus，metestrus

發(fā)情期犬(F1、F4)子宮肌壁平均厚度為65mm，內(nèi)膜平均厚度為55.5mm，內(nèi)膜腺體增生、腺腔大、部分腺體呈分枝狀彎曲(圖2)，腺上皮腫大，胞漿淡染，偶見核下空泡(圖3)，間質(zhì)纖維疏松，血管較多。內(nèi)層肌纖維增粗，著色淡。血管層血管數(shù)量多而大，部分血管充血，外層肌纖維輕度增生，體積較大(圖4)。

2.2.2 卵巢:間情期犬的卵巢改變基本相似，即初級卵泡多而小、次級卵泡1～2個、未見成熟卵泡、卵泡間纖維增生(圖5)。黃體細胞體積較小，胞漿成顆粒狀，排列不規(guī)則，部分細胞間境界不清、核大小不等，主要改變是可見黃體細胞呈空泡變性(脂肪變)，間質(zhì)纖維輕度增生、血管少(圖6)。

發(fā)情期犬卵巢中卵泡數(shù)量多，有初級卵泡、次級卵泡和1～2個成熟卵泡(圖7)。黃體細胞數(shù)量多，排列規(guī)則，境界清楚，未見空泡變性，間質(zhì)纖維比較疏松，血管多(圖8)。

3 討論

犬為季節(jié)性單次發(fā)情，1年只發(fā)情1次，發(fā)情期所持續(xù)時間為1周左右，但由于馴化時間較長，家犬已經(jīng)不再1年只發(fā)情1次。犬在發(fā)情開始LH峰后1～2 d開始排卵，排卵前卵泡已經(jīng)黃體化，因此卵泡中的孕激素水平較高，而大多數(shù)哺乳動物排卵后才形成黃體，卵泡中雌激素水平較高;且大多數(shù)哺乳動物排出的卵母細胞已經(jīng)成熟，處于第二次減數(shù)分裂的中期(MⅡ期)，而犬排卵發(fā)生在第1次減數(shù)分裂開始時，排卵后不久生發(fā)泡發(fā)生破裂，卵子在輸卵管內(nèi)經(jīng)1～3 d發(fā)育至成熟［6］。由此可見犬的生殖生理不同于大多數(shù)哺乳動物，有其特殊性。

近年來隨著養(yǎng)犬業(yè)的蓬勃發(fā)展，母犬的繁殖疾病也越來越嚴重，特別是不孕癥。母犬不孕癥在臨床上主要表現(xiàn)為:發(fā)情周期延長或長期不發(fā)情;發(fā)情的外表征象不明顯;或有發(fā)情征象，但屢配不孕，有的空懷1～2年仍不懷孕［7］。

由于個體母犬的發(fā)情期存在較大的變異，僅憑經(jīng)驗和外部特征很難準確確定其是否發(fā)情排卵，因此，確定母犬發(fā)情期和排卵時間是確定交配和防止交配失敗的重要技術(shù)。目前，最基本的方法是測定外周血液孕酮濃渡，進行陰道細胞學、陰道鏡、行為學檢查。本實驗中根據(jù)犬的行為學及外觀表現(xiàn)結(jié)合性激素的血清學檢測界定其處于發(fā)情期或是間情期，避免了主觀判斷的偏差。

FSH和LH是調(diào)節(jié)卵泡正常發(fā)育成熟及甾體激素合成所必需的，LH過低可能導致雌激素合成前體不足，卵泡早期顆粒細胞對FSH的反應低下，卵泡中、晚期顆粒細胞LH受體表達不足，卵巢旁分泌調(diào)節(jié)紊亂，從而影響卵泡的早期發(fā)育和最后成熟［8］。但有資料表明 LH的半衰期很短，為實驗研究和臨床診斷增添了很多不便，本實驗中LH測定值普遍偏低可能與其半衰期短有關(guān)。因此對于待測樣品應及時離心析出血清并于－70℃暫時存放，盡可能在一周內(nèi)測定結(jié)束。人的正常黃體期P峰值＞15 ng/mL。P峰 ＞10 ng/mL提示排卵，＜10 ng/mL提示黃體功能不全，提示不排卵［9］。在本實驗中兩只發(fā)情犬的 P值均 ＜5 ng/mL，分析犬只可能是處于排卵前期，或者是人與犬的種屬差異性，其P峰值不同。

研究表明，間情期犬子宮及其內(nèi)膜較薄，間質(zhì)纖維增生，黃體中以初級卵泡為主，可見1～2個次級卵泡，未見成熟卵泡，卵泡和黃體細胞間纖維較多、血管少。發(fā)情期犬子宮及其內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜腺體腔較大，部分腺體呈分枝狀彎曲，腺上皮腫大，胞漿淡染，少數(shù)可見核下空泡。卵巢中卵泡數(shù)量較多，有初級、次級和1～2個成熟卵泡。黃體細胞數(shù)量多，排列規(guī)則，境界清楚，間質(zhì)纖維比較疏松，血管多，未見空泡變性。間情期和發(fā)情期卵巢中未見明顯白體?？芍雅莸陌l(fā)育及黃體形成和卵巢間質(zhì)纖維內(nèi)血管層的形成關(guān)系密切，這與林秋華等的闡述:卵泡的生長和黃體的形成是依賴血管形成的，血管形成對維持正常的卵巢生理起重要作用相一致［10］。

致謝:感謝蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科全體工作人員的支持!特別感謝已是八十高齡，仍致力于實驗病理研究工作的老專家盧開柏主任!

［1］邢華.犬卵母細胞的體內(nèi)成熟環(huán)境與體外成熟培養(yǎng)［J］.動物學雜志，2009，44(6):160－165.

［2］孔德強，李愛學，曾林，等.一種比格犬雌二醇β受體剪切異構(gòu)體的克隆和序列分析［J］.中國比較醫(yī)學雜 志，2011，21(7):44－47.

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［4］孫敬方.動物實驗方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:194－195.

［5］仲劍平.醫(yī)療護理技術(shù)操作常規(guī)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，1998.

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［7］王樹聲，付偉，赫廣偉，等.母犬不孕癥的病因和防治措施［J］.當代畜牧，2002，10:29－30.

［8］羅江霞.LH在IVF中應用的探討［J］醫(yī)學信息臨床醫(yī)學分冊，2011，24(9):5750－5751.

［9］孫尚軍.185例不孕癥婦女血清生殖激素測分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2004，12(1):80－90.

［10］吳獻青，林秋華，張志勝.卵巢血管形成與卵巢生理［J］.國外醫(yī)學計劃生育分冊，2002，21(2):94－97.

Comparison of the Uterus and Ovarian Morphology between Diestrus and Estrus Beagles

XU Qin1，2，REN Xiu－mei3，ZHAO Yan－bin4，HU Zhong－ming4，LI Jian－ying2，SUN Zhao－zeng4，SUI Li－h(huán)ua4，LIU Yi4，LIU Wen－sen1
(1.Institute of Military Veterinary，Academy of Military Medical Sciences，Chang Chun 130122，China.2.Department of Laboratory Animals，Urumqi General Hospital，Lan Zhou Military Districts ，Urumqi 830000，China.3.Department of Agriculture，JI－Lin University，Chang Chun 130000，China.4.Laboratory Animal center，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China.)

Objective To compare the uterine and ovarian morphologies between diestrus and estrus Beagles for the further study of their reproductive inefficiency.Methods Detected the serum sexual hormone of 23 Beagle bitches，which have been produced once or twice，using chemiluminescence and selected 2 estrus and 4 diestrus Beagles by serological identification for ovarian and uterine specimens，4% neutral paraformaldehyde－fixed，paraffin－embedded，routine HE stained，photographed.Results The uterus and endometrium of diestrous dogs are thin，interstitial fibrosis，corpus luteum are occupied by primary follicles，1－2 visible secondary follicles，no mature follicles.Follicular and luteal cells have more fiber，less vascularized.While the uterus and endometrium of estrus Canines are more thicken，endometrial cavity is larger，part of the gland is branched bend，glandular cells are enlarged，cytoplasm pale dyed，with a small number of visible vacuoles under the nuclear.Ovarian follicles are in large numbers，and are mainly primary，secondary and 1－2 mature follicles.There are numeric luteal cells which arranged regulatory，state clearly，loose interstitial fibrosis，vascular，and no vacuolar degeneration.Diestrus and estrus dogs’ovarian have no obvious white body.Conclusion Diestrous Beagle sex hormone is maintained at a relatively low level，in proestrus estrogen levels increased rapidly，and after ovulation progesterone levels were higher.Morphological changes of ovary and uterus are adapted to the estrous cycle of bitches.

Beagles;Estrus;Diestrus;Morphology

圖1 間情期子宮壁增殖期改變(HE4×)Fig.1 Diestrus uterine Wall proliferation phase(HE4×)

圖2 發(fā)情期犬子宮內(nèi)膜腺體增生(HE10×)Fig.2 Estrus canine endometrial hyperplasia(HE10×)

圖3 發(fā)情期子宮內(nèi)膜腺體腺上皮水腫(HE 40×)Fig.3 Estrus endometrial glandular epithelial edema(HE40×)

圖4 發(fā)情犬子宮內(nèi)膜血管層(HE10×)Fig.4 Estrous canine endometrial vascular layer(HE10×)

圖5 間情期犬未成熟卵泡(HE4×)Fig.5 Diestrous dog immature follicles(HE4×)

圖6 間情期犬黃體細胞空泡變性(HE10×)Fig.6 Diestrous dog luteal cell vacuolation(HE10×)

圖7 間情期犬卵巢間質(zhì)纖維(HE10×)Fig.7 Diestrous dog ovarian interstitial fibrosis(HE10×)

圖8 發(fā)情期犬成熟卵泡(HE4×)Fig.8 Estrus dog mature follicles(HE4×)

R332

A

1671－7856(2012)07－0044－04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.012

2012－07－05

國家自然科學基金資助項目(31172164)。

共同第一作者:許琴(1974－)，女，博士生，基礎(chǔ)獸醫(yī)學專業(yè)，Email:xuqin740831@163.com。任秀梅(1987－)，女，碩士生，臨床獸醫(yī)學專業(yè)，Email:renxiumei602@163.com。

胡仲明，Email:huzhongming2005@sina.com;劉文森，Email:Liuws85952@163.com。