隋麗華，孫兆增，劉 一，張小飛，崔曉霞，趙彥斌，劉 冰，許 琴，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，北京 100071)

獼猴B病毒gC蛋白特異性抗原表位的合成和表達(dá)

隋麗華，孫兆增，劉 一，張小飛，崔曉霞，趙彥斌，劉 冰，許 琴，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，北京 100071)

目的 獲得B病毒gC蛋白的特異性表位抗原。方法 利用長片段基因合成的方法，合成B病毒C蛋白的特性抗原表位基因，將該基因連接到pMAL-5x載體，轉(zhuǎn)化到BL21受體菌進(jìn)行表達(dá)，并純化表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果 成功的獲得了B病毒gC蛋白的特異性抗原蛋白，該蛋白以可溶的形式表達(dá)。結(jié)論 利用原核表達(dá)系統(tǒng)，可以產(chǎn)生B病毒gC蛋白的可溶性抗原，可以作為B病毒的檢測抗原。

獼猴B病毒;C蛋白;抗原表位;合成與表達(dá)

獼猴B病毒(macaque B virus)是人獸共患病病毒，在自然宿主獼猴體內(nèi)多呈潛伏感染，一般不表現(xiàn)臨場癥狀。B病毒在幼猴體內(nèi)的存在比率約10%左右，隨著年齡的增加，陽性率越來越高，在有些飼養(yǎng)場的老年猴群中，B病毒的陽性率在90%左右。B病毒陽性的獼猴，終生攜帶病原，傳染性較強(qiáng)。因此，及時、準(zhǔn)確的檢測出B病毒，并控制其傳播，對于獼猴的生產(chǎn)和人獸共患病的防控，具有重要意義。

獼猴B病毒屬于皰疹病毒屬，為生物安全4級病原，因此在研制獼猴B病毒的檢測試劑時，用全病毒做抗原檢測抗體的可行性較小，而它與人的單純皰疹病毒1型(human simple herpes virus-1，HSV-1)和人的單純皰疹病毒2型(human simple herpes virus-1，HSV-2)病毒具有較強(qiáng)的抗原交叉性，目前多用人單純皰疹病毒做抗原替代獼猴B病毒，但作為診斷試劑，不僅要求靈敏度高，而且要求具有良好的特異性，才能更好地區(qū)別B病毒與其它皰疹病毒［1，2］。

用于B病毒檢測的重組抗原主要是其囊膜蛋白gB、gC和 gD，gB重組蛋白作為抗原，檢出率最高，但特異性較差，gD的檢出率和特異性都較差。gC蛋白作為重組抗原的檢出率雖然低于 gB，但特異性強(qiáng)，其不僅參與病毒的吸附［8，9］，還對病毒粒子的釋放、病毒的毒力以及病毒粒子的穩(wěn)定性有影響［10］。其作為獼猴B病毒診斷的候選抗原具有一定優(yōu)勢。因此，本研究選擇B病毒gC的特異性抗原表位區(qū)域，采用長片段基因合成的方法合成這段基因，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，期望獲得靈敏性和特異性較好的重組蛋白，為獼猴B病毒檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株和質(zhì)粒

pMAL-5x載體，BL21(DE3)plys菌株為本室保存。

1.2 主要試劑

凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自杭州BioFlux公司;LA-Taq、dNTP、NdeⅠ和 EcoRⅠ內(nèi)切酶、ligase均為大連寶生物公司產(chǎn)品;E.coli DH5α感受態(tài)為北京博邁德公司產(chǎn)品。IPTG，X-Gal為sigma公司產(chǎn)品。

1.3 基因合成

從GenBank上獲得B病毒的 gC蛋白序列，并將其與人的單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒等的 gC蛋白序列進(jìn)行比較。選擇gC蛋白序列中，抗原表位強(qiáng)，但與其它皰疹蛋白同源性較低的序列，進(jìn)行合成，合成序列的總長度為468 bp，基因片段的兩端分別添加NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)?；蚱斡缮虾＝萑鹕锕こ逃邢薰竞铣?，命名為gC合。

1.4 pMAL-5x-gC合載體的構(gòu)建

利用NdeⅠ和EcoRⅠ兩種限制性內(nèi)切酶將gC合從基因合成的質(zhì)粒上切下，利用ligase將片段定向連接到pMAL-5x載體。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，利用PCR和酶切的方法篩選出陽性質(zhì)粒pMAL-5x-gC合。

1.5 合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將pMAL-5x-gC合轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)plys感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落在含10mmol/L葡萄糖的LB中37℃培養(yǎng)至OD值為0.6，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG，室溫誘導(dǎo)4 h。取50μL誘導(dǎo)后的菌液與等體積的2倍上樣緩沖液混合，煮沸10 min。樣品上樣量為20μL，利用10%的 SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.6 重組蛋白的純化

1L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌濃度為2×108(OD值約為0.5)，加入IPTG的終濃度至0.3mmol/L，室溫(25～30℃)誘導(dǎo)表達(dá)4 h。離心去上清，用25mL的上柱緩沖液重懸，－20℃過夜。冰浴中融化，超聲破碎，離心，保留上清，采用麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析柱純化目的蛋白，用包含10mmol/L麥芽糖的上柱緩沖液進(jìn)行洗脫，收集純化蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離膠的濃度為10%。利用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，觀察電泳結(jié)果，并照相。

2 結(jié)果

2.1 基因合成結(jié)果分析

gC合基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定見圖1，基因片斷與預(yù)期結(jié)果基本相符。

圖1 重組質(zhì)粒P5X-gC合雙酶切鑒定Fig.1 Enzyme digestion analyses of the recombinant plasmid P5X-gC合

2.2 pMAL-5x-gC合載體的構(gòu)建結(jié)果分析

將gC合從基因合成的質(zhì)粒上切下后，利用ligase將片段定向連接到pMAL-5x載體。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞(如圖2)，利用PCR和酶切的方法篩選出陽性質(zhì)粒pMAL-5x-gC合，結(jié)果如圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pMAL-5x-gC合PCR、雙酶切鑒定鑒定Fig.2 Enzyme digestion analyses of the recombinant plasmid pMAL-5x-gC合

2.3 合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將pMAL-5x-gC合轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的表達(dá)情況，如圖3，在約70×103處出現(xiàn)蛋白條帶，與預(yù)期重組蛋白的分子質(zhì)量吻合。

圖3 SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)Fig.3 Detection of recombinant protein expression by SDS-PAGE

2.4 重組蛋白的純化

重組誘導(dǎo)后，柱層析純化的蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳，得到目的條帶，可近一步用于ELISA試劑盒研制。

圖4 SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)、純化Fig.4 Detection of recombinant protein expression and Purification by SDS-PAGE

3 討論

猴感染BV后，急性期在口腔或皮膚有潰瘍，并排毒，約10 d癥狀消失，抗體上升，此時病毒潛伏于面部和生殖道附近神經(jīng)節(jié)，遇機(jī)體抵抗力下降可激活病毒。猴BV在排毒期可通過接觸、抓傷、咬傷傳染給人，發(fā)生腦炎，死亡率達(dá) 80%［3－7］，因此 B 病毒的檢測和防控具有重要的意義。但由于猴BV屬于生物安全4級病原，全病毒做為抗原檢查猴 BV，最低需要生物3級實(shí)驗(yàn)室條件才能完成，所以，一般實(shí)驗(yàn)室均用人單純皰疹病毒(HSV)作為診斷抗原，此種檢測方法降低了安全隱患，但檢測的準(zhǔn)確性也隨之降低。

為了減少非特異性檢測結(jié)果，近年來，國內(nèi)已有利用基因工程技術(shù)產(chǎn)生猴BV囊膜重組蛋白，肖鏡［3］等表達(dá)了猴 BV gD 蛋白片段，王代平［4］等表達(dá)了猴BV gC蛋白片段，均證實(shí)重組蛋白具有良好的抗原性，但抗原的特異性和靈敏性有待進(jìn)一步提高。本試驗(yàn)選擇猴BV的gC蛋白的抗原表位強(qiáng)，但與其它皰疹蛋白同源性較低的序列，進(jìn)行合成，并對其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化。由該基因產(chǎn)生的重組蛋白，理論上抗原的特異性和靈敏性符合檢測要求。

本試驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)對該合成基因進(jìn)行了表達(dá)。原核系統(tǒng)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是重組蛋白產(chǎn)量大，但易產(chǎn)生包涵體，蛋白質(zhì)的活性較低。因此我們選擇了pMAL-5x這種表達(dá)質(zhì)粒，這種重組質(zhì)粒可以產(chǎn)生麥芽糖結(jié)合蛋白融合的重組蛋白，明顯增強(qiáng)重組蛋白的可溶性。最終結(jié)果表明，gC合基因是以可溶的形式表達(dá)，這為下一步的檢測試劑盒的制備奠定了基礎(chǔ)。

［1］Jennifer L H，Peter A B.B-virus(cercopithecine herpesvirus 1)infection in humans and macaques potential for zoonotic disease［J］.Emerg Infect Dis，2003，9(2):246－250.

［2］Yamaoto H， Ohsawa K， Walz S E， et al. Validation of anenzyme-linked immunosorbent assay kit using herpesvirus papio2(HVP2 )antigen for detection of herpesvirus simiae (Bvirus)infection in rhesus monkeys［J］.Comp Med，2005，55( 3): 244－8.

［3］肖鏡，付瑞，賀爭鳴，等.猴B病毒gD-多肽ELISA檢測方法的建立［J］.實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)，2008，25(2):20－23.

［4］王代平，葉華虎，曾林，等.猴 B病毒囊膜蛋白 gC基因密碼子優(yōu)化及其在大腸埃希中的表達(dá)［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32(5):1－4.

［5］Xuan X，Kojima A，Murata T，et al.Analysis of canine herpes virus gB，gC and gD expressed by a recombinant vaccine virus［J］.Arch Virol，1997，142:1003－1010.

［6］Besecher M Ⅰ，Harden H E，Li G，et al.Discovery of herpes B virus-encoded micro RNAs［J］.Virology，2009，83(7):3413－3416.

［7］吳小閑.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測手冊 實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)監(jiān)測分冊［M］.北京:衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會，1992:69.

［8］Li Y，van Drunen Little van den HurkS，Babiuk L A，et al.Characterization of cell-binding properties of bovine herpesvirus 1 glycotroteins B，C，and D:identification of adual cell-binding function of Gb［J］.J Virol，1995，69:4558－4568.

［9］Liang X，Babiuk L A，van Drunen Little van den Hurk S，et al.Bovine herpes virus 1 attachment to permissive cells is mediated by its major glycoproteins gⅠ，gⅢ and gⅣ［J］.J Virol，1991，65:1124－1132.

［10］練蓓，程安春，汪銘書.皰疹病毒gC基因及其編碼蛋白研究進(jìn)展［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2009，17(2):82－86.

Synthesis and Expression of Monkey B Virus Glycoprotein C Specific Antigen Epitope

SUI Li-hua，SUN Zhao-zeng，LIU Yi，ZHANG Xiao-fei，CHUI Xiao-xia，ZHAO Yan-bin，LIU Bing，XU Qin，ZENG Lin
(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China)

Objective To get specific antigen epitope of B virus gC protein.Methods Synthesis specific antigen epitope of B virus gC gene by using synthesis gene of Long fragment，cloned the gene into the pMAL-5x vector and transformed into E.coli BL21 to express and purify the expression product.Results We get the B virus gC protein specific antigen protein successfully，and the protein expression in soluble form.Conclusion Prokaryotic expression system can produce soluble B virus gC protein antigen and can be used as the detection of B virus antigen

Macaque B Virus;gC protein;Antigen epitope;Synthesis and expression

Q95-331;R332

A

1671-7856(2012)07-0021-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.006

2012-07-05

十二五重大專項(xiàng)“高致病病原動物模型研究”(2012ZX10004502)。

隋麗華(1970－)女，高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向:實(shí)驗(yàn)動物微生物檢測。

曾林(1965－)研究員，研究方向:實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理。