鄭壽煥 楊秀麗 李蘭 車惠英 王敬銜 姚慶春

糖尿病是最常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，是一種多基因疾病，遺傳因素在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，近年來學(xué)者們應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，研究糖尿病的候選基因，探討其遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道，在不同種族、不同地區(qū)的2型糖尿病患者中線粒體基因的突變率不同，線粒體基因突變與糖尿病關(guān)系的觀點(diǎn)不一［1，2］。本研究對(duì)延邊地區(qū)328例2型糖尿病患者(其中80例有家族史)及108例正常對(duì)照組線粒體DNA ND4基因進(jìn)行突變分析，旨在探討延邊地區(qū)T2DM患者線粒體DNA基因變異情況及線粒體基因變異與2型糖尿病的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者108例:男65例、女43例，平均年齡(30.4±9.7歲)作為正常對(duì)照組，臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查均正常，排除肝、腎、內(nèi)分泌和心腦血管疾病，近3個(gè)月無服用任何藥物史;選取2009年12月至2012年2月在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者328例:男194例、女134例，平均年齡(35.1±6.9)歲。糖尿病診斷依據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除妊娠、急性感染、腫瘤、外傷、心、肝疾病及服用羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、噻唑烷二酮類藥物者。根據(jù)線粒體DNA基因變異情況將T2DM患者分為基因變異組和基因非變異組。所有受檢對(duì)象均為延邊地區(qū)無血緣關(guān)系個(gè)體，均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 ①基因組DNA提取:采用Promega公司生產(chǎn)的Wizard@Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被受檢者肘靜脈血2 ml到加有EDTA抗凝劑的真空采血管中，并立刻顛倒混勻，置于離心機(jī)中3000轉(zhuǎn)離心10 min，取300 μl白細(xì)胞加入到1．5 m l離心管中，按照細(xì)胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白質(zhì)、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的過程分別加入試劑，進(jìn)行DNA的提取。所得DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，并置于-70℃保存?zhèn)溆?。②PCR擴(kuò)增 m tDNA ND4區(qū)域基因片段，根據(jù)GenBank中所報(bào)告的序列參考文獻(xiàn)報(bào)道［3］，采用北京華美公司合成的上游引物上游引物:5′-TTT ACCACAACACAATGGGG-3′，下 游 引 物 5′-AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT-3′;PCR 擴(kuò)增體系(50 μl):包括 5×Green GO Taq Buffer 10 μl，MgcL22 μl，dNTP 1 μl，上游 1 μl，下游1 μl，Taq DNA 聚合酶，0．25 μl，滅菌注射用水29．75 μl，DNA 5 μl;PCR循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。③PCR產(chǎn)物的限制性酶切:20μl酶切體系包括PCR產(chǎn)物5μl，HincII內(nèi)切酶 0．5 μl，滅菌注射用水14．5 μl，置于 37℃水浴箱中水浴 3 h。5%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序:PCR產(chǎn)物用凝膠電泳DNA回收試劑盒純化回收DNA片段后，送北京奧萊博生物技術(shù)有限責(zé)任公司，完成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17．0軟件包進(jìn)行分析。主要檢測(cè)指標(biāo)均進(jìn)行資料分布類型檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的各統(tǒng)計(jì)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，行t檢驗(yàn)，率的比較行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA ND4(nt11990-12199)區(qū)域經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為209bp(見圖1)，限制性內(nèi)切酶HincⅡ酶切識(shí)別位點(diǎn)為GTY↓RAC(R=A或G，Y=G或T)，線粒體DNA 12026位點(diǎn)發(fā)生變異時(shí)將被分割成171bp和38bp兩個(gè)片段。(見圖2)。直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)線粒體基因12026位點(diǎn)發(fā)生A→G變異(見圖3)。

2.2 在328例2型糖尿病患者中共檢出線粒體DNA 12026 A→G變異20例，其變異率為6．1%;在108例對(duì)照組中檢出線粒體DNA 12026 A→G變異1例，其變異率為0．9%(χ2=4．740，P ＜0．05)(見表1)。

2.3 2型糖尿病患者中線粒體基因12026A→G變異組與非變異組在空腹血糖，糖化血紅蛋白及肌酐比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0．05;在病程，體重指數(shù)，餐后2 h血糖等臨床資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P ＞0．05(見表2)。

圖1 線粒體基因ND4(12026)2%瓊脂糖凝膠泳結(jié)果

圖2 HincⅡ酶切線粒體基因ND4(12026)5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3 線粒體基因ND4 12026(A→G)變異反向測(cè)序圖

表1 線粒體ND4基因12026在病例組與對(duì)照組中的變異情況(例，%)

表2 2型糖尿病患者線粒體基因12026A→G變異及非變異的臨床生化指標(biāo)(±s)

表2 2型糖尿病患者線粒體基因12026A→G變異及非變異的臨床生化指標(biāo)(±s)

組別 例數(shù)(n)病程(years)BMI(kg/m2)FBG(mmol/L)PBG(mmol/L)HbA1c(%)Cr(μmol/L)9 8．38 ±0．74 92．75 ±8．81非變異 308 8．83 ±5．78 23．84 ±2．40 5．92 ±1．68 10．59 ±1．95 7．36 ±0．49 74．42 ±14．94 P 值 0．75 0．64 0．02﹡ 0．11 0．001﹡ 0．02變異 20 8．08 ±5．48 24．36 ±2．87 7．93 ±2．24 12．28 ±2．9﹡

3 討論

線粒體是真核生物中的細(xì)胞器，是細(xì)胞的供能場(chǎng)所，它主要通過氧化磷酸化為生物組織和細(xì)胞提供進(jìn)行生命活動(dòng)所需的的能量和ATP。mtDNA是獨(dú)立于細(xì)胞和染色體以外的由16569個(gè)堿基對(duì)組成的環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯功能。每個(gè)卵細(xì)胞含有幾十萬(wàn)個(gè)線粒體DNA，而精子的線粒體集中于尾部，受精時(shí)，僅精子頭部與卵子細(xì)胞融合成成合子，受精卵中的線粒體遺傳物質(zhì)均來自于母系，因此mtDNA的遺傳是母系遺傳而不是孟德爾遺傳特點(diǎn)［4］。

線粒體DNA 12026A→G的突變使得由其編碼的異亮氨酸被纈氨酸取代，該變異改變了NADH脫氫酶(復(fù)合體工)亞單位4的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ-Ⅳ酶活性，影響線粒體氧化磷酸化的能力，ATP生成減少，降低胰島細(xì)胞分泌胰島素的能力，使胰島素作用缺陷，從而誘發(fā)糖尿?。?］。

文獻(xiàn)報(bào)道，日本2型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)變異，變異率為3.95%，正常人群中該位點(diǎn)的變異率為0.87%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［6］。國(guó)內(nèi)研究認(rèn)為該位點(diǎn)變異只是人群中的一種基因多態(tài)性并且該位點(diǎn)的變異與自身免疫功能有關(guān)［7，8］。本次實(shí)驗(yàn)中在328例2型糖尿病患者中共檢出線粒體DNA 12026 A→G變異20例(其中16例變異個(gè)體合并糖尿病腎損傷)，其變異率為6.1%;在108例對(duì)照組中檢出線粒體DNA 12026 A→G變異1例，其變異率為0.9%(χ2=4.74，P＜0.05)，研究結(jié)果提示，線粒體DNA 12026 A→G變異與延邊地區(qū)2型糖尿病的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

綜上所述我們認(rèn)為線粒體DNA 12026 A→G變異與延邊地區(qū)2型糖尿病的發(fā)生有一定的相關(guān)性，可能加重糖尿病的病情;線粒體DNA 12026 A→G變異與FBG，HbA1c和Cr有關(guān)。但線粒體DNA 12026 A→G變異與糖尿病腎損傷的具體關(guān)系及影響機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

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