王 睿 費洪新 李曉明 王 偉 劉 韓 牛英才 劉向民周 濤

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，老年人多發(fā)，喪失生活能力，主要是在大腦海馬區(qū)域出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)，即淀粉樣β蛋白 （amyloid β protein，Aβ），Aβ可以使組織產(chǎn)生大量自由基，干擾鈣離子代謝，影響炎癥反應(yīng)，從而引起腦神經(jīng)元發(fā)生改變，神經(jīng)元功能也會發(fā)生改變，引起AD發(fā)生[1-2]，癥狀上表現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶障礙是最早出現(xiàn)的，目前國內(nèi)外尚無特效藥物進(jìn)行治療。石菖蒲揮發(fā)油是對機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用有效成分,其中β-細(xì)辛醚是石菖蒲揮發(fā)油的主要成分，β-細(xì)辛醚對機體自由基的產(chǎn)生有重要作用，是治療神經(jīng)系統(tǒng)的一種藥物。β-細(xì)辛醚可促進(jìn)氧自由基代謝，影響大腦學(xué)習(xí)和記憶能力。本文筆者通過將飼養(yǎng)動物分組后給予β-細(xì)辛醚探討AD發(fā)病原因，且觀察對老年癡呆小鼠PKA/CREB信號通路的影響作用和快速老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響，分析β-細(xì)辛醚藥物作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 β-細(xì)辛醚購于武漢博士德生物工程有限公司，制成0.1 mg/mL混濁液，每天小鼠灌胃量是2 mL；PKA、CREB一抗、SP試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；DydatechMR4000 型酶標(biāo)儀購自SantaCruz公司，MPIAS-500 病理圖像分析系統(tǒng)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，其他均為國產(chǎn)分析醇試劑。

1.1.2 動物分組 選取健康昆明小鼠10只和快速老化小鼠30只，均為10個月大小、雄性、體重20～25 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。健康昆明小鼠10只作為對照組，30只快速老化小鼠物隨機分為模型組（10只）、實驗組（10只）、治療組（10只）。對照組采用生理鹽水灌胃，2 mL/次；實驗組采用β-細(xì)辛醚混濁液灌胃，2 mL/次；治療組采用腦復(fù)康水溶液5 mg/mL灌胃，2 mL/次；模型組采用生理鹽水灌胃，2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次，持續(xù)3周。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮定位航行實驗 實驗小鼠灌胃3周后進(jìn)行行為學(xué)測試，連續(xù)5 d，實驗前1 d適應(yīng)性訓(xùn)練，平臺放在第一象限，其他3個象限將其放入水中，每天各測1次，在2 min內(nèi)尚未找到平臺，則將其放平臺10 s；若120 s之內(nèi)找到平臺，則其在平臺10 s，實驗進(jìn)行5 d。利用上臺潛伏期代表實驗小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，采用Morrismicrosoft基礎(chǔ)類應(yīng)用程序紀(jì)錄逃避潛伏期和游泳距離，兩次潛伏期算術(shù)均值作為這一天成績進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，處理結(jié)果。

1.2.2 Morris水迷宮空間探索實驗 實驗小鼠進(jìn)行空間探索試驗是任選一個入水點將小鼠放入水池中進(jìn)行試驗，記錄各組實驗小鼠在規(guī)定的時間內(nèi)游泳軌跡，考察各組實驗小鼠對原平臺記憶，選擇任選一相同入水點將各組實驗小鼠放入水池中，記錄各組實驗小鼠在實驗進(jìn)行2 min之內(nèi)游泳路線，同時記錄停留時間，并對其進(jìn)行實驗統(tǒng)計分析，處理結(jié)果。

1.2.3 PKA、CREB的測定 實驗小鼠乙醚麻醉，斷頭取出含有海馬組織的腦組織，福爾馬林固定24 h，PBS洗滌，4℃保存12 h，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，切片組織厚度6 μm，采用海馬組織分別測定PKA、CREB，37℃溫箱孵育10 min，PBS洗滌，抗原修復(fù)10 min，正常羊血清37℃溫箱孵育10 min，一抗 （PKA、CREB 為 1 100）37℃溫箱孵育 1 h，PBS 洗滌，二抗 IgG-HRP加入后，37℃溫箱孵育 30 min，PBS洗滌，DAB顯色液顯色，PBS洗滌，蘇木精染色，脫水，透明，封片，測定部位在海馬區(qū)，使用病理圖像分析系統(tǒng)測定吸光度值，計算陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)光鏡觀察 實驗小鼠乙醚麻醉，斷頭處死，取出腦組織，沿冠狀切面切下前囟尾側(cè)2.2～4.3 mm的海馬組織，福爾馬林固定，PBS洗滌，4℃保存12 h，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚7 μm，HE染色，光鏡下觀察拍照。

1.2.5 小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)電鏡觀察 實驗小鼠乙醚麻醉，打胸后心臟灌注固定液，快速取腦，分離海馬，2.5%戊二醛預(yù)固定2 h、四氧化鋨固定，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色，電鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件處理分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮定位航行實驗和空間探索實驗結(jié)果

Morris水迷宮實驗中，模型組與對照組比較，平臺潛伏期縮短，原平臺停留時間縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明模型穩(wěn)定，可以用于實驗研究。實驗組、治療組與模型組比較，潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），實驗組、治療組與模型組比較，原平臺停留時間延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示β-細(xì)辛醚能改善快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力，增強小鼠的記憶力（表1）。

表1 各組小鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較（±s，s）

表1 各組小鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較（±s，s）

注：與模型組比較，①P ＜ 0.05，②P ＜ 0.05，aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.05；治療組比較，③P ＜ 0.05，④P ＜ 0.05；與對照組比較，⑤P ＜ 0.05，⑥P ＜ 0.05

組別只數(shù) 平臺潛伏期 原平臺停留時間實驗組治療組模型組對照組10 10 10 10 23.52 ±0.13①③24.35 ±0.20a 34.61 ±0.11⑤51.18 ±0.05 39.71 ±0.21②④37.46 ±0.04b 20.16 ±0.16⑥55.36 ±0.14

2.2 小鼠海馬神經(jīng)元PKA、CREB測定

小鼠海馬神經(jīng)元模型組與對照組比較，PKA、CREB吸光度（A）數(shù)值明顯降低，蛋白數(shù)量較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明模型組PKA表達(dá)減少，CREB信號表達(dá)減少。動物給藥后實驗組與模型組比較，PKA表達(dá)增多，CREB信號表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明β-細(xì)辛醚對快速老化小鼠治療有效（表2）。

表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)分析（±s）

表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)分析（±s）

注：與模型組比較，①P ＜ 0.05，②P ＜ 0.05；與治療組比較，③P ＜ 0.05，④P＜0.05；與對照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.05

組別只數(shù) PKA(A) CREB(A)實驗組治療組模型組對照組10 10 10 10 70.12 ±0.42①③65.74 ±0.21 50.31 ±0.23a 96.17 ±0.54 85.24 ±0.38②④80.17 ±0.14 65.13 ±0.24b 88.45 ±0.69

2.3 光學(xué)顯微鏡觀察小鼠海馬神經(jīng)元

倒置相差顯微鏡下觀察，對照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞清晰可見，細(xì)胞形狀錐體形，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞器豐富，可見明顯的尼氏體，顯示蛋白石合成旺盛（圖1a）；模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)多邊形，細(xì)胞核較小，核仁不清晰，細(xì)胞整體損傷嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較少（圖1b）；治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀錐體形或、長梭形，細(xì)胞器部分可以看到（圖1c）；實驗組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞少量損傷，細(xì)胞邊界較清晰，細(xì)胞形態(tài)較完整（圖1d）。

2.4 電子顯微鏡觀察小鼠海馬神經(jīng)元

對照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀是錐體形，細(xì)胞器豐富，可見大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，神經(jīng)原纖維豐富、排列規(guī)則有序（圖2a）。模型組則小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核周邊結(jié)構(gòu)混亂，脂滴較多，細(xì)胞器較少（圖2b）。治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器清晰可見，線粒體豐富，異物顆粒較少（圖2c）。實驗組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷較少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，神經(jīng)原纖維較豐富，突觸小泡較多（圖2d）。

3 討論

AD是一種臨床常見的老年性記憶障礙疾病，由多種原因造成，國內(nèi)外對于AD病因并不很清楚，AD的產(chǎn)生與大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞淀粉樣蛋白沉積、膽堿能神經(jīng)纖維損傷、老年斑沉積形成、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、化學(xué)性突觸結(jié)構(gòu)改變、突觸密度喪失、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的生成減少等[3]有關(guān)。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD的發(fā)生是脾腎虧虛，痰濕阻滯，痰濁淤血所致，治療上以調(diào)節(jié)脾腎虧虛為主，痰濁淤血為輔。

AD動物模型首推SAM-P/8 小鼠，該模型是日本京都大學(xué)竹田俊男教授開發(fā)的一種較理想的快速老化小鼠模型，SAM-P/8 小鼠模型壽命較短、老化較快、海馬神經(jīng)元變性壞死、小鼠腦皮質(zhì)萎縮等病理改變典型，老年性癡呆是小鼠的主要癥狀特征。本文應(yīng)用β-細(xì)辛醚觀察對快速老化SAM-P/8 小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)影響，快速老化小鼠Morris水迷宮實驗表明，β-細(xì)辛醚可明顯改善SAM-P/8 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，模型組與正常組比較，尋找平臺潛伏期長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組能縮短尋找平臺潛伏期，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05），說明β-細(xì)辛醚對SAM-P/8 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力有所改善。

β-細(xì)辛醚還可以影響細(xì)胞Ca2+的代謝，通過刺激大腦海馬神經(jīng)元，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加，導(dǎo)致第二信使cAMP濃度增加，激活蛋白質(zhì)依賴的PKA磷酸化，磷酸化有活性的PKA能改善化學(xué)性突觸結(jié)構(gòu)功能改變[4-6]。活化的PKA可以磷酸化CREB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，使各種信息可以長期保存，就會記住事件的發(fā)生過程。動物給藥后實驗組與模型組比較，PKA表達(dá)增多，CREB信號表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明β-細(xì)辛醚對快速老化小鼠治療有效果。β-細(xì)辛醚可增強PKA蛋白的表達(dá)量，來維持大腦海馬神經(jīng)元PKA/CREB這種特殊的信號通路傳導(dǎo)。

光鏡下對照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞清晰可見，細(xì)胞形狀錐體形，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞器豐富，可見明顯的尼氏體，顯示蛋白石合成旺盛；模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)多邊形，細(xì)胞核較小，核仁不清晰，細(xì)胞整體損傷嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較少；治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀呈錐體形或長梭形，細(xì)胞器部分可以看到；實驗組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞少量損傷，細(xì)胞邊界較清晰，細(xì)胞形態(tài)較完整，這些顯示β-細(xì)辛醚可改善老年性癡呆癡呆模型中大腦海馬神經(jīng)元的病理特點，增強海馬神經(jīng)元的學(xué)習(xí)記憶能力，減弱老年性癡呆的癥狀。電鏡下模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核周邊結(jié)構(gòu)混亂，脂滴較多，細(xì)胞器較少。治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器清晰可見，線粒體豐富，異物顆粒較少。實驗組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷較少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，神經(jīng)原纖維較豐富，突觸小泡較多，電鏡照片顯示β-細(xì)辛醚能減輕癡呆小鼠大腦海馬神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，β-細(xì)辛醚對老年癡呆的PKA/CREB信號通路有明顯的改善作用，β-細(xì)辛醚能增強該信號通路的傳導(dǎo)，達(dá)到治療老年性癡呆的目的。

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