柴路維，姜 蓉，何小茜，黃 燕，楊 戎

(重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室生理教研室，重慶400016)

轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor4，ATF4)是ATF家族的一員，該家族識(shí)別順式作用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子cAMP效應(yīng)元件，是一種包含Jun和Fos結(jié)合位點(diǎn)的DNA結(jié)合蛋白，屬于較大的堿性白氨酸鏈超家族［1］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它能使腫瘤細(xì)胞在乏氧或其他應(yīng)激的腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)細(xì)胞存活，啟動(dòng)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［2-5］。此外，ATF4能誘導(dǎo)同一信號(hào)通路的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的轉(zhuǎn)錄［6］，而 VEGF 已證實(shí)在著床過程中起重要作用［7］。鑒于胚胎植入過程與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的相似性以及目前對(duì)ATF4在胚胎植入方面的作用未見報(bào)道，本研究旨在探討ATF4在早孕小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律和在胚泡著床過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本的收集:清潔級(jí)昆明種系小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量25～30 g［由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(渝)20050002］。按雌雄2∶1自然合籠，次晨發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠1 d。隨機(jī)將小鼠按妊娠天數(shù)分為 8 組(分別為0、1、2、3、4、5、6 和7 d)，每組20只，各組小鼠到時(shí)點(diǎn)后尾靜脈注射臺(tái)盼藍(lán)0.2 mL，15 min后脫頸處死，取出子宮刮取除胚泡外的雙側(cè)子宮內(nèi)膜。另取每組8只小鼠，取子宮立即放入4% 多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片(4 μm)備用。

1.2 主要試劑

RT-PCR試劑 (TaKaRa公司);一抗 (兔抗小鼠ATF4抗體) (Proteintech Group公司);二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)(Santa cruz公司);免疫組化試劑盒 (北京中山生物公司);蛋白提取試劑盒 (凱基公司)、化學(xué)發(fā)光檢驗(yàn)試劑盒ECL(上海碧云天公司)。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR:按試劑盒說明提取總RNA，判定RNA純度及濃度;取部分RNA凝膠電泳，確定其完整性。RT-PCR引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。ATF4基因(NM009716)上游引物:5'-CAAAACAAGACAG CAGCCACTA-3'，下游引物:5'-CTTCTTCCCCCTTGC CTTAC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為186 bp;內(nèi)對(duì)照引物β-actin基因上下游引物分別為:5'-CCTGAGGCTC TTTTCCAGCC-3'，5'-TAGAGGTCTTTACGGATGTCA ACGT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為110 bp。嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明操作:將總 RNA先反轉(zhuǎn)錄為cDNA。20 μL PCR反應(yīng)體系，先94℃變性4 min，然后進(jìn)入循環(huán):94℃變性30 s，57 ℃ 退火45 s，72℃ 延伸30 s，循環(huán) 35次，最后再延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，圖像分析儀掃描分析并攝像。用Quantity one 4.0軟件分析各條帶吸光度值/mm2，計(jì)算各組吸光度比值。

1.3.2 免疫組織化學(xué):常規(guī)石蠟包埋子宮組織，制備切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，一抗ATF4工作濃度1∶200，操作過程均按組織化學(xué)染色試劑盒說明進(jìn)行。棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.3 Western blot:按照試劑盒說明操作，常規(guī)裂解組織獲取總蛋白、測(cè)定蛋白濃度。等量上樣PAGE分離，PAGE分離蛋白用10%的分離膠，5%積層膠;將PAGE分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上;加入一抗、二抗。以ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X線膠片上曝光、顯影、定影。以 GAPDH為內(nèi)參。用 Quantity One4.0軟件分析成像圖譜，計(jì)算各組小鼠子宮內(nèi)膜ATF4蛋白的比值。

1.3.4 在體實(shí)驗(yàn):將16只妊娠d3的小鼠隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組(8只)，麻醉后于腹部切一1 cm切口，向左側(cè)宮角內(nèi)注射5 μL ATF4抗體(稀釋濃度1∶150)，右側(cè)子宮角注射5μL 0.9%氯化鈉注射液對(duì)照，縫合切口，飼養(yǎng)至孕8 d脫頸處死，剖腹觀察雙側(cè)子宮胚胎著床數(shù)。另外8只孕3 d鼠作為對(duì)照組，雙側(cè)子宮角均注射0.9%氯化鈉注射液。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR產(chǎn)物定性與半定量分析

妊娠各組小鼠子宮內(nèi)膜ATF4 mRNA的表達(dá)量均顯著高于未孕組0 d(P＜0.05)，總體表達(dá)呈先增高再下降的趨勢(shì)，其中妊娠4 d表達(dá)最強(qiáng)(圖1，表1)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)ATF4 mRNA在妊娠0～7 d天小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)Fig 1 The expression of ATF4 mRNA in endometria of mice from 0 day to 7 days by RT-PCR

表1 各組小鼠ATF4/β-actin吸光灰度比值Table 1 Ratio of ATF4/β-actin in each group(x ± s，n=5)

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

ATF4在妊娠0～7 d腺上皮細(xì)胞、腔上皮細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá);0～2 d基質(zhì)細(xì)胞幾乎無(wú)表達(dá)，但從3 d表達(dá)量逐漸增多且隨妊娠的天數(shù)增加，于4 d達(dá)到高峰，隨后逐漸下降(圖2)。

2.3 Western blot結(jié)果

在圍著床期表達(dá)的是50 ku的ATF4。妊娠各組表達(dá)顯著高于未孕組0 d;4 d表達(dá)量最高(P＜0.05)(表1，圖3)。

2.4 在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組左右側(cè)子宮胚泡著床數(shù)分別為2.4±0.9和7.0±1.6;對(duì)照組左右側(cè)子宮胚泡著床數(shù)分別為6.8±0.8和6.2±1.3;實(shí)驗(yàn)組注射ATF4抗體的左側(cè)胚胎著床數(shù)較右側(cè)明顯減少(P＜0.01)。對(duì)照組左右側(cè)胚泡著床數(shù)無(wú)明顯差異(圖4)。

3 討論

ATF4是一種應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，近期研究表明，腫瘤組織局部低氧，ATF4高表達(dá)。缺氧時(shí)，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinaseR-likeER kinase，PERK)被激活，通過磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α，eIF2α)抑制蛋白質(zhì)合成并活化ATF4，繼而上調(diào)C-EBP同源蛋白(C-EBP homologous protein，CHOP)基因表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞適應(yīng)腫瘤缺氧環(huán)境［8-9］。另外ATF4可誘導(dǎo)下游基因VEGF高表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［6］。胚胎植入過程與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程極為相似，且已有研究證實(shí)VEGF在著床中起重要作用［7］，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探討ATF4在胚胎植入過程中的作用。

圖2 ATF4在妊娠0～7 d小鼠子宮的表達(dá)Fig 2 Expression of ATF4 in mouse uterus during pregnancy 0～7 days(×400)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，妊娠早期各組小鼠子宮內(nèi)膜ATF4 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著高于未孕組0 d，隨妊娠天數(shù)的增加表達(dá)量逐漸增多，于4 d達(dá)高峰，之后逐漸下降。另外，組化結(jié)果顯示ATF4蛋白主要在基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，且在胚胎著床期明顯增加。

胚胎的成功植入與蛻膜細(xì)胞不斷增殖、凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡有重要聯(lián)系［10］。本實(shí)驗(yàn)，ATF4在3～6 d的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量隨妊娠天數(shù)的增加而逐漸增多之后下降，與著床前蛻膜化進(jìn)程同步，表明ATF4可能是參與蛻膜化進(jìn)程的一個(gè)重要因子。一方面可能與孕早期滋養(yǎng)層絨毛在發(fā)育過程中處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路被激活，CHOP表達(dá)上調(diào)，促使基質(zhì)細(xì)胞增生并向蛻膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān);另一方面這一時(shí)期ATF4信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活促使VEGF高表達(dá)，使血管通透性增強(qiáng)，進(jìn)而抑制蛻膜細(xì)胞過度凋亡，為植入做準(zhǔn)備:這提示ATF4可能通過下游基因VEGF的作用增強(qiáng)子宮內(nèi)膜容受性。

為了進(jìn)一步探討ATF4在著床過程中的作用，本研究應(yīng)用子宮角注射ATF4抗體進(jìn)行功能研究［11-12］。結(jié)果顯示ATF4抗體對(duì)胚泡著床有明顯的抑制作用，表明ATF4可能是一種在胚胎植入中起重要作用的細(xì)胞因子，但本實(shí)驗(yàn)中ATF4抗體并不能完全抑制胚胎著床，是因?yàn)橹策^程受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，而這個(gè)復(fù)雜的過程中ATF4并非是唯一的因素。

總之，本研究結(jié)果顯示，ATF4在小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜呈時(shí)空特異性表達(dá)，提示ATF4可能參與子宮內(nèi)膜蛻膜化過程，在胚泡早期植入中發(fā)揮作用。但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

［1］Ameri K，Harris A L.Activating transcription factor 4［J］.J Biochem Cell Biol，2008，40:14-21.

［2］Ye Jiangbin，Koumenis C.ATF4，an ER stress and hypoxiainducible transcription factor and its potential role in hypoxia tolerance and tumorigenesis［J］.Curr Mol Med，2009，9:411-416.

［3］Busk M，Toustrup K，S?rensen BS，et al.In vivo identification and specificity assessment of mRNA markers of hypoxia in human and mouse tumors［J］.BMC Cancer，2011，11:63.

［4］Namba T，Hoshino T，Tanaka K，et al.Up-regulation of 150-kDa oxygen-regulated protein by celecoxib in human gastric carcinoma cells［J］.Mol Pharmacol，2007，71:860-870.

［5］ Zhang Z，Yin J，Zhang C，et al.Activating transcription factor 4 increases chemotherapeutics resistance of human hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Biol Ther，2012，13:435-442.

［6］ Chakraborty G，Jain S，Kundu GC.Osteopontin promotes vascular endothelial growth factor-dependent breast tumor growth and angiogenesis via autocrine and paracrine mechanisms［J］.Can Res，2008，68:152-161.

［7］Halder J B，Zhao X，Soker S，et al.Differential exp ression of VEGF isoforms and VEGF(164)-specific receptor neuropillin-1 in the mouse uterus suggests a role for VEGF(164)in vascular permeability and angiogenesis during implantation［J］.Genesis，2000，26:213-224.

［8］Gomez E，Powell ML，Bevington A，et al.A decrease in cellular energy status stimulates PERK-dependent eIF2alpha phosphorylation and regulates protein synthesis in pancreatic beta-cells［J］.Biochem J，2008，410:485-493.

［9］Cao J，Dai DL，Yao L，et al.Saturated fatty acid induction of endoplasmic reticulum stress and apoptosis in human liver cells via the PERK/ATF4/CHOP signaling pathway［J］.Mol Cell Biochem，2012.doi:10.1007/s11010-011-1211-9.

［10］Correia-da-Silva G，Bell SC，Pringle JH.Patterns of uterine cellular Proliferation and apoptosis in the implantation site of the rat during pregnancy［J］.Placenta，2004，25:538-547.

［11］ YANG Huan，XIE Yi，YANG Rong，et al.Expression of p16INK4a in mouse endometriumandits effect during blastocyst implantation［J］.Acta Physiologica Sinica，2008，60:547-552.

［12］Hai-Lan Ma，Tan Zhang，Jun Meng，et al.The role of T-lymphoma invasion and metastasis inducing protein 1 in early pregnancy in mice［J］.Mol Hum Reprod，2008，14:589-594.