王建輝，劉永樂，李赤翎，劉冬敏，尹欣欣，李 艷，王群輝

1長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410114;2長(zhǎng)沙高新開發(fā)區(qū)大自然生物科技有限公司，長(zhǎng)沙 410205

微波改性竹炭顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性腹瀉大鼠免疫性能和消化吸收功能的影響

王建輝1，2*，劉永樂1，李赤翎1，劉冬敏1，尹欣欣1，李 艷2，王群輝2

1長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410114;2長(zhǎng)沙高新開發(fā)區(qū)大自然生物科技有限公司，長(zhǎng)沙 410205

旨以研究活性竹炭顆粒(MABCP)對(duì)實(shí)驗(yàn)性腹瀉大鼠免疫性能和消化吸收功能的影響，在大鼠飼糧中分別添加0.05，0.10，0.15%的經(jīng)KOH微波活化處理的竹炭顆粒，對(duì)模型大鼠進(jìn)行為期一周的飼養(yǎng)試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn):經(jīng)KOH微波活化的竹炭顆粒，比表面積與吸附性能大幅增強(qiáng)，其能顯著降低腹瀉大鼠稀便率(P＜0.05)，有效增加胸腺和脾臟指數(shù)(P＜0.05);顯著提高腹瀉大鼠血清D-木糖含量(P＜0.05)，但對(duì)消化酶如淀粉酶活性無顯著影響(P＞0.05);腸道線粒體琥珀酸脫氫酶、NADH脫氫酶、H+-ATP酶活性顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，MDA生成量顯著降低(P＜0.05)。試驗(yàn)表明MABCP可提高體積免疫性能，改善小腸吸收功能，減少腸道自由基生成，有效維持或改善細(xì)胞氧化磷酸化水平，其中以低劑量添加效果更為明顯。

微波改性竹炭顆粒;大鼠;免疫性能;消化吸收功能;細(xì)胞氧化磷酸化

我國(guó)竹材資源豐富，而竹炭是竹材快速熱裂解的主要產(chǎn)品之一，其比表面積豐富，表面擁有羧基、酚羥基等含氧官能團(tuán)和少量含硫、氫、氯等其他元素的表面官能團(tuán)。因其特殊的表面物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，已成為一種在環(huán)保、醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景的新型吸附材料［1］。旨以提高竹炭的比表面積與吸附能力，常對(duì)其予以活化，國(guó)內(nèi)以往多以磷酸法和微波活化制備活性炭為主［2-5］，且研究主要集中在對(duì)其產(chǎn)品性能與性狀分析，而對(duì)其生理活性功能研究甚少。本研究擬采用KOH微波輻射活化的竹炭［6］，在明晰其比表面積特征及其吸附性能參數(shù)的基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)性腹瀉大鼠飼養(yǎng)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其對(duì)大鼠免疫及消化吸收功能的影響，為MABCP在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

活性竹炭:自制，竹材取自湖南省安化縣。

1.1.1 試劑

D-木糖，間苯三酚，氫氧化鉀、亞甲基藍(lán)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、碘化鉀、硫代硫酸鈉、重鉻酸鉀、可溶性淀粉、硫酸銅、98%硫酸、37%鹽酸等均為分析純;MDA、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，NADH、ATP均由Amresco公司提供。

1.1.2 儀器

LD-04型四兩裝高速中藥粉碎機(jī)(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，MAS-I-900型常壓微波輔助合成反應(yīng)儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)，SHBШ循環(huán)水式多用真空泵(開封市宏興科教儀器廠)，DHG-9036A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(南京安奈試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，BS323S電子天平(南京庚辰科學(xué)儀器公司)，HQL150B大振幅恒溫冷凍搖床(武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司)，721W微機(jī)型可見分光光度計(jì)(天津匯科儀器設(shè)備有限公司)，3H-2000Ш型全自動(dòng)氮吸附比表面積測(cè)試儀(貝士德儀器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MABCP制備工藝及性能

先將竹材廢料微波裂解制備得到的炭樣粉碎過篩(800～200 μm)，稱取炭粉200.0 g，用40 mL一定濃度的KOH溶液浸泡，浸泡一段時(shí)間后濾干，放入帶蓋瓷坩鍋中，然后送入微波爐并采用一定的微波功率加熱使之活化。對(duì)活化后的產(chǎn)品先冷卻到室溫，而后進(jìn)行酸洗(酸洗采用體積分?jǐn)?shù)為10%的稀鹽酸溶液)、漂洗(使物料的pH值在6～7之間)、抽濾、烘干，最后得MABCP。根據(jù)以往研究結(jié)果，選擇KOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%，浸漬時(shí)間24 h，微波功率800 W，活化時(shí)間7 min;在此工藝條件下制備的竹質(zhì)活性炭比表面積大，吸附性能優(yōu)良，其碘吸附值為1356 mg/g，亞甲基藍(lán)吸附值為283 mg/g，比表面積達(dá)1436 m2/g。

1.2.2 大鼠飼養(yǎng)試驗(yàn)及評(píng)價(jià)指標(biāo)

大鼠腹瀉型大鼠造模參照田佳鑫等［7］的方法，選用50只體重、日齡相近的健康清潔級(jí)SD幼齡大鼠，按20 mg/kg BW灌服200 g/L番瀉葉浸劑，1次/d，連續(xù)7 d。在灌服3 d后，禁食不禁水32 h，由肛門注入80 g/L的乙酸0.05 mL，倒提20 s。造模成功后，隨機(jī)分成5個(gè)處理組，陰性對(duì)照組、模型組和MABCP低、中、高劑量3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)處理組10只大鼠。在典型大鼠日糧基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)組分別添加MABCP，0.05%、0.10%和0.15%，自由飲水，自由采食，實(shí)驗(yàn)期為7 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食2 h后稱重，按每公斤體重口腔灌注10%D-木糖溶液1 mL，在灌注60 min時(shí)采血，靜置60 min，3000 rpm離心10 min，取血清，-70℃保存待用;斷髓處死，迅速取出小腸腸段待用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)測(cè)定

按金昔陸等［8］方法制備小腸上皮細(xì)胞線粒體，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量;采用伍期專等［9］方法測(cè)定NADH脫氧酶活性;采用定磷法［10］測(cè)定H+-ATP酶活性;比色法定量測(cè)定琥珀酸脫氫酶活性;采用TBA化學(xué)法測(cè)定MDA含量。另外，采用間苯三酚比色法測(cè)定血清中D-木糖濃度，碘-淀粉比色法測(cè)定淀粉酶，稀便率=稀便糞粒數(shù)/總糞粒數(shù);胸腺指數(shù)=胸腺重量/體重;脾臟指數(shù)=脾臟重量/體重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 6.12進(jìn)行ANOVA方差分析，同時(shí)開展DUCAN式多重比較，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MABCP對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠稀便率的影響

稀便率是反映腹瀉程度的重要指標(biāo)。為期7 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)性腹瀉大鼠飼糧中添加MABCP，低、中、高劑量均可顯著降低大鼠稀便率(P＜0.05)(表1)。竹炭顆粒由于其強(qiáng)大的比表面積和吸附性能，能有效吸附動(dòng)物消化系統(tǒng)中動(dòng)物飼料產(chǎn)品中殘存的或消化過程中產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)［11］，減少其對(duì)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸道微生態(tài)環(huán)境的危害，能有效控制腸道疾病的發(fā)生，維持腸道生態(tài)平衡和腸道健康。

表1 MABCP對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠稀便率的影響Table 1 Effect of MABCP on diarrhea rate in experimental rats

2.2 MABCP對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠免疫參數(shù)的影響

MABCP的添加可有效增加胸腺和脾臟指數(shù)(P＜0.05)(圖1)，其中，低劑量組脾臟指數(shù)與對(duì)照組相當(dāng)，顯著高于模型組和中、高劑量組(P＜0.05)。動(dòng)物體內(nèi)的微生物可以很容易地被吸附于竹炭?jī)?nèi)表面，且活性竹炭揮發(fā)性成分中含有大量微生物賴以生存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而微生物又能分解竹炭吸附的其余有害物質(zhì)［11］，從而維持腸道健康，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。

2.3 MABCP對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠消化吸收功能的影響

D-木糖是一種戊糖，口服后經(jīng)小腸吸收，在體內(nèi)不被肝臟代謝，經(jīng)腎臟排出，故血清D-木糖含量是小腸吸收功能呈正相關(guān)的較為敏感和特異的檢測(cè)指標(biāo)［12，13］;淀粉酶活性是反映消化酶分泌情況較為敏感和特異的檢測(cè)指標(biāo)［13-15］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):MABCP可以顯著提高腹瀉模型大鼠血清D-木糖含量(P＜0.05)，改善小腸的吸收功能，其中，低劑量組血清D-木糖含量與對(duì)照組相當(dāng)，顯著高于模型組和中、高劑量組(P＜0.05);但對(duì)消化酶如淀粉酶活性的分泌無顯著影響(圖2)。

2.4 MABCP對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠細(xì)胞氧化磷酸化水平的影響

琥珀酸脫氫酶是細(xì)胞線粒體內(nèi)膜氧化磷酸化的標(biāo)志酶之一，其比活性可以反映細(xì)胞氧化磷酸化功能情況［16，17］。NADH脫氫酶是呼吸鏈復(fù)合物中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的酶復(fù)合物，其活性下降可導(dǎo)致氧化磷酸化耦聯(lián)程度降低，線粒體功能受損，引發(fā)能量生成障礙;同時(shí)，電子傳遞鏈中電子漏出增多，超氧自由基生成增加。而氧自由基的增加，其引起線粒體內(nèi)與ATP合成密切相關(guān)的H+-ATP酶活性下降，導(dǎo)致ATP合成減少，氧化磷酸化作用失衡。研究發(fā)現(xiàn): MABCP可顯著提高機(jī)體腸道上皮細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶的活性(P＜0.05)，其中，以低劑量效果更佳，與對(duì)照組相當(dāng)(P＜0.05);同時(shí)，線粒體NADH脫氫酶、H+-ATP酶活性顯著高于模型組(P＜0.05)，低于對(duì)照組(P＜0.05);MDA的生成量顯著低于模型組(P＜0.05)，高于對(duì)照組(P＜0.05)(圖3，4)。由此可知，在實(shí)驗(yàn)性腹瀉大鼠飼糧中添加MABCP，線粒體內(nèi)細(xì)胞氧化磷酸化相關(guān)酶類活性顯著增強(qiáng)，顯著減少氧自由基及自由基代謝產(chǎn)物MDA的生成，從而有效維持或改善細(xì)胞氧化磷酸化水平。究其原因，可能緣于活性竹炭顆粒碩大的內(nèi)表空間，可有效吸附有害微生物，改善腸道免疫環(huán)境，同時(shí)，其能發(fā)射遠(yuǎn)紅外線，釋放負(fù)離子，釋放水平達(dá)木炭的5倍［18-20］;而負(fù)離子可為細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)充大量的自由電子，減少自由基和活性氧的生成，從而有效改善腸道細(xì)胞環(huán)境與結(jié)構(gòu)，維持其正常功能的發(fā)揮，保證呼吸鏈的暢通。

3 討論與結(jié)論

眾所周知，竹材取材容易，竹子以無性生殖方式繁殖，以加速竹子新陳代謝，5年以上尚未使用的成熟老竹就必須砍除，故竹材的取用，對(duì)環(huán)境綠化影響較小。竹炭是竹材在高溫下熱解后的固體產(chǎn)物，竹材經(jīng)炭化后，其微管束、薄壁組織縮小，孔結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因其特殊的微孔結(jié)構(gòu)和生物特性，近年來備受關(guān)注［21］。竹炭?jī)?nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，當(dāng)炭化溫度達(dá)600℃時(shí)，竹炭孔徑分布隨溫度的升高逐漸從0.25～50 μm收縮到0.55～5.50 μm［22］;比表面積增大，自250～300 m2/g可達(dá)2123 m2/g［23］，因此具有很強(qiáng)的吸附能力。同時(shí)，竹炭含碳率(約75～86%)較木炭(≥87～93%)低，不適合作為燃料型炭材。經(jīng)活化處理后的竹炭具有更加優(yōu)良的吸附、過濾功能特性，如在700℃炭化所得竹炭，碾碎至150～300 μm，再用KOH粉予以活化，其比表面積可從300 m2/g增大到2500 m2/g［20，24］。

消化道是動(dòng)物體內(nèi)物質(zhì)代謝和能量代謝最為旺盛的系統(tǒng)之一，也是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官，消化系統(tǒng)的發(fā)育、氧化還原狀態(tài)、酶系及微生物菌群的平衡是保證其功能正常的必要條件，而幼齡動(dòng)物由于消化道發(fā)育不完整、腺體功能不全、微生物區(qū)系不健全等原因，極易受外界因素的影響而導(dǎo)致消化道疾病。因此尋找新的消化道調(diào)節(jié)劑，并探索其對(duì)幼齡動(dòng)物消化道發(fā)育、功能的調(diào)節(jié)機(jī)理，可有效地預(yù)防和控制消化道疾病、提高動(dòng)物健康水平，具有十分重要的理論和實(shí)際意義。

本研究在國(guó)內(nèi)外首次探討了活性竹炭顆粒對(duì)幼齡模型大鼠消化道功能及其免疫性能的影響，研究使用的MABCP，其比表面積為1436 m2/g，吸附性能大大增強(qiáng)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可控制腸道稀便率，維護(hù)腸道健康，同時(shí)，提高機(jī)體免疫能力，在不影響動(dòng)物消化能力的基礎(chǔ)上改善動(dòng)物的吸收能力，有效維持或改善細(xì)胞氧化磷酸化水平。究其原因，可能源于竹炭顆粒能有效吸附動(dòng)物飼料中或飼料消化代謝過程中產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)，從而降低腹瀉大鼠模型動(dòng)物的進(jìn)一步損傷，表現(xiàn)出對(duì)模型動(dòng)物免疫性能及腸道消化吸收功能的良好修復(fù)作用，其中以低劑量效果更佳。然而，由于此領(lǐng)域的研究甚少，旨以明晰活性竹炭顆粒的生理功能及其作用機(jī)理，有待進(jìn)一步開展體內(nèi)體外的相關(guān)研究。

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Effect of Microwave Modified Bamboo Charcoal Particles on Immune Performance and Digestive Absorption Function of Experimentally Induced Diarrhea Rats

WANG Jian-hui1，2*，LIU Yong-le1，LI Chi-ling1，LIU Dong-min1，YIN Xin-xin1，LI Yan2，WANG Qun-hui2

1Department of Chemistry and bioengineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114，China;2Supernatural Biotechnology Co.Ltd，Changsha High-Tech development Zone，Changsha 410205，China

In order to investigate the effect of bamboo charcoal particles on immune performance and digestive absorption function of experimentally induced diarrhea rats，microwave activated bamboo charcoal particles(MABCP)was added into their diets at 0.05%，0.10%，and 0.15%to conduct a 7-day feeding trials.Microwave activation significantly enhanced the specific surface area and adsorption performance of bamboo charcoal particles.When MABCP were added into the rat diet，diarrhea rate was significantly reduced(P＜0.05)，and the thymus and spleen indices were effectively increased(P＜0.05).Serum D-xylose content was significantly improved in the diarrhea rats(P＜0.05)，but not for digestive enzymes such as amylase activity(P＞0.05).Intestinal mitochondrial NADH dedydrogenase，H+-ATPase and succinate dehydrogenase activities were increased(P＜0.05)and MDA content was decreased significantly(P＜0.05).The results indicated that MABCP could improve immune performance，enhance the small intestinal absorption function，decrease radical production and maintain/ameliorate cellular oxidative phosphorylation level;the comparatively optimal dietary level of MABCP was 0.05%.

microwave activated bamboo charcoal particles;rat;immune performance;digestive absorption function;cellular oxidative phosphorylation

TS231

A

1001-6880(2012)05-0677-05

2011-05-16 接受日期:2011-10-31

第39批留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目;湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11JJ6025);湖南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010NK3004);湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(10C0391)

*通訊作者 E-mail:wangjh0909@yahoo.com