任麗平，張 智，李柏林，譚 洪

1重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400030;2西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南充 637000

活性污泥中Fe(Ⅲ)還原微生物的分離、鑒定及還原特性

任麗平1，2，張 智1*，李柏林1，譚 洪2

1重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400030;2西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南充 637000

采用平板分離法和檸檬酸鐵還原實驗法相結(jié)合，從城市污水處理廠活性污泥中分離獲得Fe(Ⅲ)還原菌F7，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化和16S rDNA序列分析及同源性比對鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。在不同檸檬酸鐵濃度和不同pH條件下的實驗表明，檸檬酸鐵濃度為0.32 g/L時，菌株生長情況較好，檸檬酸鐵濃度為0.16 g/L時，F(xiàn)e(Ⅲ)異化還原比例較高;pH 6.5時，菌株生長情況較好，F(xiàn)e(Ⅲ)異化還原量較多。

活性污泥;Fe(Ⅲ)還原微生物;系統(tǒng)發(fā)育分析;Fe(Ⅲ)異化還原

Fe(Ⅲ)還原微生物是具有Fe(Ⅲ)異化還原功能的一類微生物的總稱，它與C、N循環(huán)，多種金屬元素和非金屬元素的轉(zhuǎn)化緊密相關(guān)，能促進自然條件下難降解的有機污染物的氧化降解［1-6］;還可以影響到除Fe(Ⅲ)之外的很多重金屬以及放射性核素，使有毒的高價態(tài)還原為低價態(tài)或形成沉淀，使其毒性降低［7-9］。國內(nèi)從2000年前后，逐漸關(guān)注了有關(guān)Fe(Ⅲ)還原微生物及其在環(huán)境污染治理中的作用［10-13］，研究了Fe(Ⅲ)異化還原對水稻土壤中N、P、K、Si等營養(yǎng)元素的有效性和CH4，CO2及N2O形成的影響［14，15］，而活性污泥中的Fe(Ⅲ)還原微生物的研究未見報道，其重要的生物修復(fù)功能未被開發(fā)。

隨著我國城鎮(zhèn)污水處理廠出水排放標(biāo)準(zhǔn)的進一步提高，水里的重金屬的問題以及污泥的無害化處置面臨更新、更高的要求?，F(xiàn)今的城市污水廠多采用生物處理技術(shù)，對污水生物處理技術(shù)的改進從某種程度上依賴于高活性功能菌的獲得及其性能的研究和開發(fā)利用，目前對于相關(guān)微生物的研究還不夠成熟。由于Fe(Ⅲ)還原微生物具有強大的代謝功能和在生物修復(fù)中的強大優(yōu)勢，因而開展活性污泥中Fe(Ⅲ)還原微生物的分離和特性研究，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本實驗從活性污泥中分離Fe (Ⅲ)異化還原菌，并對其進行生理生化特征、16S rDNA進化分析和Fe(Ⅲ)異化還原特性研究，旨在為豐富Fe(Ⅲ)還原微生物，充分利用含鐵工業(yè)廢水實現(xiàn)高效節(jié)能的污水處理、污泥處置和水體修復(fù)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

活性污泥取自城市污水處理廠厭氧段、缺氧段各2份，共4份。

1.2 培養(yǎng)基

PTYG培養(yǎng)基(每L):蛋白胨0.25 g，胰蛋白胨0.25 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖0.5 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2·2H2O 0.07 g，瓊脂粉10 g，pH 7.0。

LB液體培養(yǎng)基(每L):NaCl 10 g，酵母粉5 g，蛋白胨10 g，pH 7.0。

檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基(每L):檸檬酸鐵0.34 g，NH4Cl 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.007 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，K2HPO4·3H2O 0.0733 g，KH2PO40.025 g，葡萄糖1g，pH6.5-7.0。

1.3 菌株的分離及純化

分別取4份活性污泥原液逐級稀釋至10-4，將稀釋后的活性污泥分別加于PTYG液體培養(yǎng)基中，厭氧避光27℃培養(yǎng)2 d，然后涂布于PTYG固體培養(yǎng)基上，厭氧避光27℃培養(yǎng)，挑取單菌落純化至菌落特征一致，無異常菌落出現(xiàn)者，然后于LB液體培養(yǎng)基厭氧避光27℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的菌液各取750 mL于離心管3000 rpm離心15 min，棄去上清液，用無菌水洗2次，再用750 mL無菌水懸浮沉淀制得菌液，各吸取10 μL轉(zhuǎn)入裝有檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中，厭氧避光27℃培養(yǎng)3 d。

挑取培養(yǎng)過程中檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基由黃綠色逐漸變?yōu)榘咨木贽D(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，27℃厭氧培養(yǎng)1 d后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌株的生理生化鑒定

觀察菌株的菌落在培養(yǎng)基上的形狀、大小、顏色、粘稠度、透明度、邊緣和隆起情況，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰氏細菌學(xué)鑒定手冊》和《一般細菌常用鑒定方法》進行菌株生理生化鑒定。

1.5 菌株的16S rDNA分析

提取細菌總DNA［16］，以總DNA為模板擴增其16S rDNA。PCR反應(yīng)體系(50 μL):無菌去離子水37.5 μL，10×Buffer 5.0 μL，MgCl23 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L引物 1(5’-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 1.0μL，引物2(5’-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)1.0 μL，Taqplus聚合酶(5 U/ μL)0.5 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 min，30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min，4℃保溫2 h。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳EB染色后，用紫外分析儀檢測。用上海生工的 UNIQ-100DNA膠純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠上的PCR產(chǎn)物，用TaKaRaPMD19-T載體試劑盒進行連接(操作方法按試劑盒說明)，轉(zhuǎn)化Escherichia coliDH5的感受態(tài)細胞，然后在含氨芐青霉素Amp/IPTG/Xgal的平板上篩選白斑，并進行菌體PCR初步檢測，再經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒，其產(chǎn)物進行電泳檢測。16S rDNA的測序由上海生工完成。用BLAST軟件，將測定得到的16S rDNA全序列遞交于GenBank，并與GenBank/EMBL/DDBJ中的已知序列進行同源性分析。

1.6 不同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度菌株的生長及特性測定

活化菌株，分別接種于鐵濃度為0.64、0.32、0.16 g/L的檸檬酸鐵培養(yǎng)液(pH7.0)中，并設(shè)置無鐵對照組，厭氧避光27℃靜置培養(yǎng)，每5 h測定培養(yǎng)基中上清液Fe(Ⅱ)濃度和菌OD值。

1.7 不同pH條件下菌株的生長及特性測定

活化菌株，分別接種于pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的檸檬酸鐵培養(yǎng)液(鐵濃度均為0.32g/L)中，厭氧避光27℃靜置培養(yǎng)，每5 h測定培養(yǎng)基中上清液Fe(Ⅱ)濃度和菌OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe(Ⅲ)異化還原菌的分離和鑒定

在4份樣品中分離純化出8個形態(tài)不同的菌落，其中3個菌落來源于厭氧段活性污泥，5個菌落來源于缺氧段活性污泥。檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)7 d，來源于缺氧段活性污泥、編號為F7的菌液的顏色完全變白，表明檸檬酸鐵被還原，菌株F7具有還原Fe(Ⅲ)的功能。

菌株F7在PTYG固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落特征為圓形，表面光滑，邊緣平整，不透明，濕潤。顯微鏡下觀察菌體形態(tài)短桿狀、稍有彎曲，運動活潑，成波浪式運動或翻轉(zhuǎn)運動。革蘭氏染色呈陰性，芽孢染色呈陰性。生理生化反應(yīng)結(jié)果見表1，經(jīng)biolog鑒定，菌株 AP3屬于Pseudomonas putida，相似度為0.933，屬于革蘭氏陰性非腸道菌。

在GenBank上用Blast程序?qū)闒7進行核苷酸同源性比對，菌株F7與Pseudomonas putidastrain J312的同源性為99.8%，將菌株F7序列和下載的16S rDNA序列通過ClusrerW進行聚類分析后，利用MEGA4.0軟件以Neighbor-Joining計算方式生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹(距離計算采用Jukes-Cantor模式)如圖1，可以看到菌株F7與菌株P(guān)seudomonas putidastrain J312聚到一起，親緣關(guān)系較近。根據(jù)生理生化實驗和16S rDNA序列分析及同源性比對確定菌株F7為Pseudomonas putida。

表1 BIOLOG細菌鑒定儀鑒定的菌株的生理生化特征Table 1 Physiological biological characteristics of strain by BIOLOG bacteria identification instrument

圖1 基于假單胞菌屬內(nèi)16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences homology ofPseudomonassp.

活性污泥中假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌株多次被分離鑒定，Brodishch［17］等的研究表明，除磷活性污泥中的優(yōu)勢菌是假單胞菌屬和氣單胞菌屬，假單胞菌屬是厭氧/好氧條件下的主要菌種之一，并在試驗過程中一直保持著較為穩(wěn)定的優(yōu)勢地位。人們主要關(guān)注了活性污泥中假單胞菌屬的聚磷特性［18-20］，而本實驗篩選的惡臭假單胞菌F7具有Fe (Ⅲ)異化還原功能，以其作為研究對象，對進一步研究污水處理和污泥處置問題具有一定的代表性和創(chuàng)新性。

2.2 不同鐵濃度條件下菌的生長曲線及Fe(Ⅲ)異化還原特性

不同鐵濃度條件下的實驗表明，檸檬酸鐵濃度為0.32 g/L時，菌生長情況最好，其他次之(見圖2);與無鐵對照組比較，檸檬酸鐵促進了菌的生長。如圖3所示，F(xiàn)e(Ⅱ)濃度經(jīng)歷了一個由緩慢變化到開始明顯增長的過程，這與水稻土中鐵的微生物還原特征相似［15］，這主要是因為Fe(Ⅲ)成為厭氧條件下的主要電子受體和菌的生長以及鐵還原活性的恢復(fù)都需要一定時間，即Fe(Ⅲ)的異化還原有一個啟動期，本實驗中，啟動期約10 h。在之后的10～25 h快速還原期中，檸檬酸鐵濃度為0.16 g/L時的Fe(Ⅲ)異化還原速率較檸檬酸鐵濃度為0.32 g/L和0.64 g/L時的Fe(Ⅲ)異化還原速率低;以產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)的濃度與Fe(Ⅲ)初始濃度之百分比作為Fe(Ⅲ)還原比例，見圖4，F(xiàn)e(Ⅲ)還原比例隨Fe (Ⅲ)濃度的增加而下降。

由于城市污水處理廠往往添加以Fe(Ⅲ)為主要成分的化學(xué)藥劑改善除磷效果，一些工業(yè)廢水中也含有Fe(Ⅲ)，使得Fe(Ⅲ)在活性污泥中大量存在，成為厭氧條件下有機物氧化最重要的電子受體。在鐵還原微生物的異化作用中，F(xiàn)e(Ⅲ)被用作電子受體，還原產(chǎn)生Fe(Ⅱ)，能偶聯(lián)多種有機物的氧化。因此活性污泥中高活性的鐵還原微生物為污水處理和污泥處理中的生物修復(fù)提供了廣闊的前景。

2.3 不同pH條件下菌的生長曲線及Fe(Ⅲ)異化還原特性

微生物有其最佳生長pH，酶促還原也要求有最佳的反應(yīng)pH，因此環(huán)境中的pH會直接影響到Fe (Ⅲ)異化還原過程，同時pH還會影響到Fe(Ⅲ)的存在形態(tài)，在酸性條件下可存在大量可溶性的Fe (Ⅲ)，增加了微生物利用Fe(Ⅲ)進行呼吸獲能的優(yōu)勢。本實驗表明，菌株F7在pH 6.5時生長得最好，隨pH 7.0、pH 6.0、pH 7.5、pH 8.0順序下降，見圖5。如圖6，F(xiàn)e(Ⅲ)異化還原情況在pH 6.5時最佳，隨pH 6.0、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0依次下降。

3 結(jié)論與展望

該實驗從活性污泥中分離得到Fe(Ⅲ)還原微生物F7，根據(jù)生理生化實驗和16S rDNA序列分析及同源性比對確定菌株F7為Pseudomonas putida。進一步實驗表明，菌株F7有較強的Fe(Ⅲ)還原能力，檸檬酸鐵濃度為0.16 g/L時Fe(Ⅲ)異化還原比例較高，檸檬酸鐵濃度為0.32 g/L時，菌生長情況較好;pH 6.5時，菌株生長情況和Fe(Ⅲ)異化還原情況較好。

該研究初步揭示了活性污泥中的Fe(Ⅲ)還原微生物及還原特性，異化Fe(Ⅲ)還原在污染環(huán)境的生物修復(fù)中具有重要優(yōu)勢，國外在能源、環(huán)境等領(lǐng)域進行了具有重要應(yīng)用價值的前沿性研究。國內(nèi)的研究處于起步階段，今后結(jié)合污水處理的運轉(zhuǎn)特點，加強利用Fe(Ⅲ)還原微生物改良污水處理效果和污泥處置的研究具有重要的現(xiàn)實價值。

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Isolation and Identification of Fe(Ⅲ)Reducing Bacteria from Activated Sludge and Their Reducing Characteristics

REN Li-ping1，2，ZHANG Zhi1*，LI Bo-lin1，TAN Hong2

1College of Urban Construction and Environmental Engineering，Chongqing University，Chongqing 400030，China;2College of Biolojical Sciences，China West Normal University，Nanchong 637000，China

A ferric reducing microorganism strain F7 was isolated from activated sludge taken from wastewater treatment plant through dilution-plate method and ferric citrate reduction.By means of the morphology，physiology and the 16S rDNA sequence analysis and homology comparison，strain F7 was identified asPseudomonas putida.Different ferric citrate fluid medium concentration and different pH experiments showed that strain F7 growed well with 0.32 g/L ferric citrate，and Fe(Ⅲ)reduction ratio was high with 0.16 g/L ferric citrate，and the bacteria growth and Fe(Ⅲ)reduction quantity were well with pH 6.5.

activated sludge;ferric reducing microorganism;phylogenetic analysis;dissimilatory Fe(Ⅲ)reduction

X172

A

1001-6880(2012)05-0627-05

2011-10-19 接受日期:2012-02-10

國家“十一五”科技重大專項——三峽庫區(qū)城市污水處理廠功能提升與污泥處理處置技術(shù)研究與綜合示范(2009ZX07315-002)

*通訊作者 Tel:86-013808350890;E-mail:zhangzhicq@126.com