劉曦 于晶晶 王紅 劉嘉馨 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 輸血研究所 （成都 610052）

高效液相色譜法測定一次性使用輸液器中DEHP溶出量

劉曦 于晶晶 王紅 劉嘉馨
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 輸血研究所 （成都 610052）

以乙醇水溶液作為浸提液，模擬臨床使用條件，建立高效液相法（HPLC）測定一次性使用輸液器中鄰苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）溶出量的方法，為制定聚氯乙烯（PVC）醫(yī)療器械產(chǎn)品中增塑劑DEHP溶出量檢測標(biāo)準(zhǔn)提供實驗依據(jù)。

一次性使用輸液器 HPLC 增塑劑 DEHP

1. 前言

鄰苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）是聚氯乙烯（PVC）類一次性使用輸液器中最具代表性的增塑劑，被廣泛使用。DEHP與PVC分子之間僅以范德華力和氫鍵相連，在臨床使用過程中，DEHP會從PVC輸液器中遷移出來，伴隨藥物輸注進入人體。近年相關(guān)研究表明，DEHP具有慢性毒性[10~11]，人體內(nèi)的長期累積會影響肌肉骨骼系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]、肝臟組織[2]，特別是男性生殖健康[3]。因此，美國FDA在其發(fā)表的關(guān)于DEHP增塑PVC醫(yī)療器械安全性評價的研究報告[4]中，提出要重視和監(jiān)控醫(yī)療器具中DEHP的釋放。鑒于此，本文建立了測定一次性PVC輸液器中DEHP溶出量的高效液相色譜法（HPLC)。

2. 材料與方法

2.1 試劑與儀器

95%乙醇（成都科隆化學(xué)試劑公司，AR），甲醇（國藥化學(xué)試劑公司，色譜純），DEHP標(biāo)準(zhǔn)品（山東宏信化工股份有限公司，純度≥99.5%），純水/超純水系統(tǒng)（美國Pall，Cascada），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA，RV10），紫外/可見光分光光度計（美國Beckman，DU800），高壓液相色譜（美國Waters，e2695-2489），國產(chǎn)一次性使用輸液器（批號：20110511 09）。

2.2 浸提液的制備

按照GB14232.1-2004中醇溶出物測定要求，用95%乙醇和超純水，通過液體比重天平測定并配制2000m L密度為(0.9373~0.9378)g/m l的乙醇水混合液作為浸提液。

2.3 色譜條件

檢測器：紫外/可見光檢測器，檢測波長n=272nm；色譜柱：Sunfire C18，5.0 μm，4.6mm×150mm；柱溫：室溫；流動相：甲醇（色譜純）；流量：1.0m l/m in；進樣量：5μl。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 DEHP 特征吸收波長的選擇

精密稱取DEHP標(biāo)準(zhǔn)品 2.0010 g，用甲醇稀釋至100m l，得到濃度為20.01 m g/m l的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋 200倍，得到0.10mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用紫外/可見分光光度計在190nm~1100nm范圍內(nèi)進行掃描，根據(jù)吸收光譜曲線確定HPLC檢測波長（n）。

2.4.2 DEHP保留時間的確定

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋得到一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在2.3色譜條件下進樣測量，得到DEHP的出峰保留時間。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇逐級稀釋，得到2001ug/m l~5ug/m l濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.3中色譜條件進樣測定，得到各濃度的峰面積值。 以峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，DEHP濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程。

2.4.4 靈敏度試驗

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇逐級稀釋，得到一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照2.3 色譜條件進樣測定，將信噪比≥100的最小DEHP濃度定為定量檢測限。

2.4.5 精密度試驗

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇逐級稀釋，得到濃度為 1500 μg/m l~5 μg/m l的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照2.3色譜條件進樣測定，每種濃度樣品連續(xù)進樣測定5次，得到其峰面積，計算變異系數(shù)（RSD），進行測量值的精確度表征，考察結(jié)果重復(fù)性。

2.4.6 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確吸取3份浸提液各1m l，與濃度分別為2000ug/m l、1000ug/m l、500ug/m l 各1m l DEHP標(biāo)準(zhǔn)工作液均勻混合，得到高、中、低三種濃度的加標(biāo)回收樣品溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，冷卻至室溫，殘余物用4m L甲醇渦旋溶解后得到樣品檢驗液，靜置數(shù)分鐘后吸取上清，按2.3色譜條件對每個加標(biāo)回收樣品檢驗液測定3次，計算回收率（%）和變異系數(shù)（RSD）。

2.5 供試液的制備及測定

將配制好的乙醇水浸提液用膠塞玻璃瓶分裝（500m l/瓶，共4瓶，），懸掛于輸液架上，取出輸液器樣品，模擬臨床操作和條件，調(diào)節(jié)流速在2.5~3.0m l/m in范圍內(nèi)（流速上限），收集全部流出液作為供試液1；重復(fù)上述操作，調(diào)節(jié)流速在0.5~1.0m l/m in范圍內(nèi)(流速下限)，依次對每瓶浸提液進行輸注，收集全部流出液作為供試液2。

將上述供試液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，冷卻至室溫，殘余物用4m L甲醇渦旋溶解后得到樣品檢驗液，靜置數(shù)分鐘后吸取上清，按2.3色譜條件進樣測定得到峰面積值，將其代入相應(yīng)線性回歸方程即得DEHP濃度（C，ug/m l），按下式換算每套輸液器的DEHP溶出量（M，mg/套）：

3.結(jié)果與討論

3.1 DEHP 特征吸收波長的確定

如圖1所示，DEHP在190nm處有飽和鍵（C-C）吸收峰、202~238nm處有不飽和鍵（C=C、C=O）和雜原子飽和鍵（C-O-C）的吸收峰，在272nm處有苯環(huán)特征吸收峰。因此，以272nm作為HPLC的檢測波長。

3.2 DEHP 出峰保留時間

見圖2。

3.3 供試液制備方法的選擇

已有不少研究[2~3],[5~8]對供試液的制備采用的是截取產(chǎn)品某一部分，對其進行浸泡和萃取的方式。這種方法在產(chǎn)品的質(zhì)量控制評價方面是可行的[5~8]，但通過這種方法測得的DEHP溶出量卻難以反映產(chǎn)品臨床實際使用時的風(fēng)險[2~3]，因為產(chǎn)品使用時與浸提液的接觸是動態(tài)過程，而浸泡方法是靜態(tài)過程，這兩種浸提過程對DEHP的浸提能力會有較大區(qū)別。另外，產(chǎn)品使用時與浸提液的接觸是整個內(nèi)腔而不是局部，所以局部浸提的結(jié)果不能反映產(chǎn)品使用的真實情況。因此本研究采用模擬臨床使用條件的供試液制備方法。

再者，輸液藥物分為晶體液類（生理鹽水、葡萄糖等）和脂類藥物。已有安全性評價結(jié)果顯示[12]，DEHP在與晶體液接觸時溶出極少，其進入人體的含量對人體幾乎沒有危害。而DEHP與脂類藥物接觸時卻容易溶出。所以我們只針對一次性使用輸液器輸注脂類藥物時DEHP溶出量進行研究。乙醇水溶液是脂類溶劑，可替代脂類藥物作為本研究的溶出檢測液。

同時針對一次性使用輸液器的使用要求，流速一般為0.5m l/m in~3m l/m in，本研究分別選擇了0.5~1.0m l/m in和2.5~3.0m l/m in兩種流速，全面考察此產(chǎn)品的DEHP溶出量。

3.4 DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

由圖3可知，線性回歸方程1：Y = 828.32X +22000，相關(guān)系數(shù)r=0.9986，結(jié)果顯示DEHP濃度在2001ug/m l~5ug/m l范圍內(nèi)與其峰面積值線性關(guān)系良好。

由于2001ug/m l~5ug/m l的線性相關(guān)范圍較寬，在確定一次性輸液器中DEHP溶出量時會存在較大誤差，因此把整個濃度范圍劃分為高、低2個濃度等級，即2001ug/m l~100ug/m l和250ug/m l~5ug/m l，分別在各自范圍內(nèi)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，如下：

圖1 . DEHP吸收光譜（190nm~400nm）

圖2 . DEHP 的HPLC 保留時間

圖4、圖5顯示，線性回歸方程2：Y = 804.71X+53814，相關(guān)系數(shù)r = 0.9982；線性回歸方程3：Y = 924.42X + 5588.6，相關(guān)系數(shù)r = 0.9991。結(jié)果顯示DEHP濃度在2001ug/m l~100ug/m l和250ug/m l~5ug/m l范圍內(nèi)與其峰面積值線性關(guān)系良好。

3.5 方法靈敏度

由表2可知，本方法的DEHP定量檢測限為0.5ug/m l。

3.6 方法精密度

見表3，RSD均＜5%，表明此方法在較寬的線性范圍內(nèi)具有良好的精密度。

3.7 加標(biāo)回收率結(jié)果

圖3 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線1（濃度范圍：2001ug/m l~5ug/m l）

圖4 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線2（濃度范圍：2001ug/m l~100ug/m l）

圖5 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線3（濃度范圍：250ug/m l—5ug/m l）

表1 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對應(yīng)峰面積值

表2 . 信噪比臨界100的DEHP標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度

表3 . 精密度試驗結(jié)果

加標(biāo)回收率測定考察的是供試液制備和處理以及儀器測試過程中待測目標(biāo)物的前處理情況，以此來衡量測試方法的可行性?；厥章室话阍?0%~110%之間比較合適[9]。結(jié)果見表4，本方法回收率均在98%~103%之間，RSD均＜5%，說明采用的測量方法準(zhǔn)確度高，精確度好。

3.8 一次性使用輸液器樣品DEHP溶出量測定

見圖6、圖7，由樣品檢驗液1和2的 DEHP色譜圖及其峰面積，對比DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線，認(rèn)為較適用的是2001ug/m l~100ug/m l范圍內(nèi)的線性回歸方程2，據(jù)此計算出樣品檢驗液1和2中的DEHP濃度（n=3），見表5。

表4 . DEHP 加標(biāo)回收率和精密度

圖6 . 樣品檢驗液1 中DEHP色譜圖例

圖7 . 樣品檢驗液2 中DEHP色譜圖例

表5 . 樣品檢驗液中DEHP含量測定結(jié)果

以2.5~3.0m l/m in的流速用此一次性使用輸液器進行輸注，在本試驗條件下每套產(chǎn)品DEHP溶出量（mg）為：524.52×4/1000=2.10

以0.5~1.0m l/m in的流速用此一次性使用輸液器進行輸注，在本試驗條件下每套產(chǎn)品DEHP溶出量（mg）為：813.89×4/1000=3.26

DEHP的溶出量與浸提液的接觸時間成正比。2.10mg的溶出量是在臨床輸注流速上限的情況下測得，浸提液與輸液器的接觸時間較短，可視為最小溶出量；而3.26g的溶出量是在臨床輸注流速下限的情況，浸提液與輸液器的接觸時間較長，屬于極限浸提，可視為最大溶出量。所以，此一次性使用輸液器在臨床使用輸注脂類藥物時的DEHP溶出量應(yīng)在2.10mg~3.26mg之間。這個數(shù)值范圍可作為本類產(chǎn)品DEHP風(fēng)險分析的參考數(shù)據(jù)。

4.結(jié)論

本試驗證明，高效液相色譜法（HPLC）在2000ug/m l~5ug/m l的較寬DEHP濃度范圍保持良好的線性關(guān)系。不同規(guī)格、不同廠家的一次性使用輸液器以及不同類型的PVC醫(yī)療器械產(chǎn)品，在臨床使用過程中DEHP溶出量可能相差較大，HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的較寬線性范圍則能很好地適應(yīng)產(chǎn)品特點，有利于確保檢測的可靠性。同時精密度和回收率試驗也表明此方法準(zhǔn)確度高、精確度好且操作簡單、分析快速，易于推廣。

在我國的醫(yī)療器械分類監(jiān)管中，其相關(guān)的國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中并沒有針對臨床實際使用條件下PVC醫(yī)療器械產(chǎn)品中的DEHP溶出指標(biāo)的限量要求和統(tǒng)一方法。因此，為更好地保護患者的身體健康，應(yīng)盡可能地在相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)上體現(xiàn)這一點。

[1] 胡曉宇,張克榮,孫俊紅等. 中國環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類化合物污染的研究. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2003, 13 (1) : 9.

[2] 鄭滌新，耿媛媛，王婕等. 導(dǎo)管類醫(yī)療器械DEHP檢測方法辨析.化學(xué)工程與裝備， 2010,6:175-176.

[3] 唐云華, 麥偉忠, 曾戎等. 體外循環(huán)管道PVC增塑劑浸出量的測定及對比. 廣州化工, 2011, 39(8):92-93.

[4] US FDA(2002): Safety assessment of di(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP) released from PVC medical devices[R].

[5] 印暉，金念祖。 紫外分光光度法測定一次性使用體外循環(huán)管道中DEHP溶出量. 藥物鑒定, 2006，15（14）：9—10.

[6] 葛海生，劉元瑞，汪 杰. 氣相色譜法測定PVC輸液袋中DEHP的含量. 武警醫(yī)學(xué), 2006，17: 97-98.

[7] 周志明，毛明英，周 冕. PVC制品中增塑劑DEHP含量的測定. 塑料科技, 2008，36（11）：82-85.

[8] 朱九群, 蘭婉玲, 張羅紅. HPLC測定PVC輸液袋中的鄰苯二甲酸二(2 - 乙基己基)酯. 華西藥學(xué)雜志, 2009，24（3）：318-319.

[9] KUMAR N, VERMA N, SONGH O, et al. Estimation of A tenolol by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography. Journal of Chemistry. 2010, 7(3): 962- 966.

[10] H. M. Koch, R. Preuss, J. Angerer. Di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP): human metabolism and internal exposure – an update and latest results. International Journal of Andrology. 2006, 29(1): 155-165.

[11] Holger M Koch, Bernd Rossbach, Hans Drexler, et al. Internal exposure of the general population to DEHP and other phthalates—determination of secondary and primary phthalate monoester metabolites in urine. Environmental Research. 2003, 93(2):177-185.

[12] 奚廷斐 王春仁. 鄰苯二甲酸二異辛酯增塑聚氯乙烯醫(yī)療器械的安全性評價. 《中國醫(yī)療器械信息》2005, 11(2): 27-30.

參考文獻

[1] GB 9706.1-2007 《醫(yī)用電氣設(shè)備 第1部分：安全通用要求》

[2] YY 0649-2008 《高電位治療設(shè)備》

Determ ination of DEHP Released from Transfusion Instrum en t for Single Use by HPLC

LIU Xi YU Jing-jing WANG Hong LIU Jia-xin
Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences (Chengdu 610052)

We used ethyl alcohol-water as leaching medium, simulating clinical operation, to develop the HPLC for determination of DEHP released from transfusion instrument for single use, in order to give the experimental foundation for establishing the test standard of the plasticizer DEHP release of PVC medical instrument. Key words: transfusion instrument for single use, HPLC, plasticizer, DEHP

1006-6586(2012)05-0029-06

R197.39

A

2011-12-02

劉曦，實習(xí)研究員；王紅，通訊作者，助理研究員