韓遠(yuǎn)遠(yuǎn)， 劉益民， 王 玉

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽合肥230022)

癲癇是一種以自發(fā)性發(fā)作為主要特征的常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病，大約影響0.5% ～2%的人群。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是人類最常見的癲癇類型，TLE的發(fā)生進(jìn)程通常包括3個(gè)階段:由最初的腦損傷事件(如腦缺血，感染，腫瘤，創(chuàng)傷性腦損傷等)引起(急性期)，進(jìn)而促使腦細(xì)胞、組織和結(jié)構(gòu)的改變(沉默期)，最終引起促癲癇環(huán)路重建導(dǎo)致自發(fā)性反復(fù)性驚厥的發(fā)生(慢性期)［1］。目前最常用的TLE動(dòng)物模型是通過系統(tǒng)注射匹羅卡品(pilocarpine，Pilo)引起癲癇持續(xù)狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)一系列促癲癇事件的改變，最終引起慢性自發(fā)性癲癇的發(fā)作［2］。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF－β1)作為多效性的因子，在缺血性腦損傷中已被證實(shí)具有控制細(xì)胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移，以及抗氧化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和阻止細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)興奮毒性、化學(xué)毒性、缺氧等引起的神經(jīng)元損傷具有直接保護(hù)功效［3－5］。作為內(nèi)源性免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦新陳代謝、細(xì)胞外離子的動(dòng)態(tài)平衡、血腦屏障的完整性、免疫功能及保護(hù)神經(jīng)元的正常功能起到至關(guān)重要的作用，同時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞的激活為TLE的一個(gè)重要特征，激活的膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的改變，這些改變可以促進(jìn)慢性期自發(fā)性驚厥的發(fā)生［6－7］，所以激活的膠質(zhì)細(xì)胞既是癲癇的結(jié)果又是促進(jìn)其原因。實(shí)驗(yàn)研究表明左乙拉西坦的抗癲癇作用是通過增加TGF－β1的分泌，經(jīng)TGF－β1介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的［8］，但是其抗癲癇具體機(jī)制尚不確切，因此本實(shí)驗(yàn)通過Pilo建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，通過滴鼻給予TGF－β1，進(jìn)一步驗(yàn)證其抗癲癇作用，并探討TGF－β1可能的抗癲癇機(jī)制及神經(jīng)保護(hù)作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

選用成年健康雄性 SD大鼠，220～250 g，SPF級(jí)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。置于安靜、避光、自由攝取食水的室溫環(huán)境下飼養(yǎng)2周，以適應(yīng)環(huán)境。

2 主要試劑

重組人TGF－β1蛋白購自Peprotech，Pilo及東莨菪堿購自Sigma，免疫組化用小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物——離子鈣結(jié)合接頭分子1(ionized calcium－binding adaptor molecule 1，Iba1)多克隆兔抗購自Wako，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體購自北京博奧森公司。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型的建立 腹腔注射(ip)東莨菪堿1mg/kg以拮抗外周膽堿反應(yīng)，30 min后，大鼠給予新鮮配制的Pilo 320 mg/kg ip，每30 min追加30 mg/kg直至癲癇持續(xù)狀態(tài)出現(xiàn)。正常對(duì)照組給予同劑量的生理鹽水注射。注射15 min后觀察大鼠行為，癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度根據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí):Ⅰ級(jí):面部陣攣，包括眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級(jí):Ⅰ級(jí)加節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí):Ⅱ級(jí)加前肢陣攣;Ⅳ級(jí):Ⅲ級(jí)加后肢站立;Ⅴ級(jí):Ⅳ級(jí)加摔倒或伴全身性陣攣發(fā)作。本研究以發(fā)作達(dá)4或5級(jí)癇性發(fā)作為誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)成功的標(biāo)準(zhǔn)。出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠，自出現(xiàn)驚厥性癇性發(fā)作后50 min，給予10%水合氯醛350 mg/kg ip終止發(fā)作。

3.2 TGF－β1滴鼻及實(shí)驗(yàn)分組 建立癲癇持續(xù)狀態(tài)模型前24 h對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠給予滴鼻處理。重組蛋白TGF－β1(Pepro－Tech)溶于無菌PBS液中，使其濃度達(dá)到50 mg/L。具體給藥方法如下:大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后，取仰臥位，并將頭頸背用4 cm×4 cm的紗布卷稍稍墊高以有利于藥物進(jìn)入后鼻腔。應(yīng)用滴鼻器經(jīng)鼻均速滴入20 μL TGF－β1(每只1 μg)，兩側(cè)鼻腔交替滴入，平均每只大鼠滴鼻用時(shí)約15 min。Pilo和正常對(duì)照組應(yīng)用相同方法給予等容量的PBS溶液。

3.2.1 實(shí)驗(yàn)一 癲癇模型建立后7 d，通過12 h視頻觀察大鼠自發(fā)性癲癇活動(dòng)，28 d時(shí)結(jié)束。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)二 膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化大鼠分別于建模后1、7、14、28 d取材。尼氏染色14 d取材。每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)大鼠數(shù)量為5只。

3.3 動(dòng)物取材及固定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別在癲癇持續(xù)狀態(tài)后1 d、7 d、14 d及28 d行斷頭取腦。大鼠腹腔麻醉后固定，開胸經(jīng)升主動(dòng)脈插管，0.9%氯化鈉注射液100 mL快速灌注以沖凈血液，后用4%多聚甲醛100 mL先快后慢灌注固定全身，后斷頭取腦，固定于4%多聚甲醛中48 h，流水沖洗標(biāo)本18 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片以觀察海馬，厚6 μm，每隔5張取1張，共收集6張，進(jìn)行染色處理。

3.4 免疫組化 切片常規(guī)脫蠟至水，按SABC法進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片后鏡檢。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn):免疫組化染色過程中以0.02 mol/L PBS代替GFAP和Iba1蛋白Ⅰ抗孵育切片。

3.5 尼氏染色甲苯胺藍(lán)法 切片入0.1%甲苯胺藍(lán)溶液2 min，保持40℃，蒸餾水沖洗后梯度乙醇分化，自然風(fēng)干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，實(shí)驗(yàn)一部分兩組間比較采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)二部分多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差(Oneway ANOVA)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGF－β1具有明顯的抗癲癇作用

正常對(duì)照(control)組大鼠無癲癇發(fā)作，Pilo組大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后第9 d出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作，TGF－β1治療組大鼠第12 d出現(xiàn)，TGF－β1治療組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、等級(jí)分?jǐn)?shù)及持續(xù)時(shí)間均較Pilo組有明顯減少，見表1。

表1 自發(fā)性癲癇發(fā)作的平均頻率、程度及持續(xù)時(shí)間Table 1.Average frequency，severity and duration of spontaneous seizures(±s.n=5)

表1 自發(fā)性癲癇發(fā)作的平均頻率、程度及持續(xù)時(shí)間Table 1.Average frequency，severity and duration of spontaneous seizures(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Pilo group.

Group Frequency(d－1) Seizure score Seizure duration(s)Pilo 6.37 ±0.44 3.21 ±0.14 53.20 ±10.03 TGF－β1+Pilo 2.32 ±0.66＊＊ 1.90 ±0.21* 37.57 ±9.20*

2 TGF－β1抑制癲癇持續(xù)狀態(tài)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活

在正常組大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞有基礎(chǔ)表達(dá)，數(shù)量較少，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為胞體較薄，周圍突起較少，為未活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。癲癇持續(xù)狀態(tài)后GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增加，1 d與正常對(duì)照組相比未見明顯差異，7 d左右數(shù)量達(dá)到高峰，14 d后逐漸減少，28 d時(shí)仍處相對(duì)較高水平。TGF－β1治療組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量較Pilo組顯著降低，14 d左右降至正常水平。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為胞體肥大，突起增大增粗，并可能出現(xiàn)極化等，見表2、圖1。

表2 不同時(shí)點(diǎn)海馬CA3區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)Table 2.The number of GFAP(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

表2 不同時(shí)點(diǎn)海馬CA3區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)Table 2.The number of GFAP(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs Pilo group.

Group 1 d 7 d 14 d 28 d Control 25.35 ±10.38 27.62 ±9.89 24.57 ±13.4526.94 ±5.72 Pilo 37.38 ±7.64 117.52 ±23.01* 84.48 ±18.24* 49.67 ±9.79*TGF－β1+pilo 33.82 ±12.61 103.89 ±19.45* 49.20 ±15.91#32.77 ±13.19

Figure 1.The expression of GFAP 14 d after status epilepticus.Bar:100 μm.A:control;B:Pilo;C:TGF－β1+Pilo.圖1 癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后海馬CA3區(qū)GFAP的表達(dá)

3 TGF－β1抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)目

與星形膠質(zhì)細(xì)胞相似，正常組Iba1(+)數(shù)量較少，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為胞體較薄，周圍有大量樹枝狀突起，為未活化小膠質(zhì)細(xì)胞。在Pilo組Iba1(+)數(shù)量迅速增加，7 d達(dá)到高峰，14 d后逐漸下降，28 d降至正常水平。TGF－β1治療組Iba1陽性細(xì)胞數(shù)變化趨勢與GFAP相似，14 d左右較Pilo組有顯著降低，基本降至正常水平。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為胞體肥大變圓，周圍突起減少，變短增粗，見表3、圖2。

表3 不同時(shí)點(diǎn)海馬CA3區(qū)Iba1陽性細(xì)胞數(shù)Table 3.The number of Iba1(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

表3 不同時(shí)點(diǎn)海馬CA3區(qū)Iba1陽性細(xì)胞數(shù)Table 3.The number of Iba1(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs Pilo group.

Group 1 d 7 d 14 d 28 d Control 19.38 ±6.52 21.22 ±8.02 20.29 ±4.71 17.61 ±7.44 Pilo 48.45 ±8.38* 112.65 ±11.81* 104.11 ±9.36* 25.98 ±5.17 TGF－β1+pilo 43.36 ±7.57* 97.17 ±9.45* 32.28 ±8.31#21.49 ±6.72

Figure 2.The expression of Iba1 14 d after status epilepticus.Bar:100 μm.A:control;B:Pilo;C:TGF－β1+Pilo.圖2 癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后海馬CA3區(qū)Iba1的表達(dá)

4 TGF－β1減少神經(jīng)元死亡

正常組大鼠CA3區(qū)見大量致密的椎體細(xì)胞，排列整齊，形態(tài)完整，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富;癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后Pilo組細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹，破裂，輪廓模糊，排列紊亂，細(xì)胞間距加大，胞漿內(nèi)尼氏小體減少;TGF－β1治療組存活神經(jīng)元較Pilo組明顯增多，見圖3。正常組CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目為104.56 ±12.33;，Pilo組為39.47 ±10.89;TGF－β1治療組為87.62±8.57;TGF－β1治療組與 Pilo組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

Figure 3.Nissl－stained sections of hippocampal CA3 region 14 d after status epilepticus.Bar:100 μm.A:control;B:Pilo;C:TGF－β1+Pilo.圖3 癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后海馬CA3區(qū)Nissl染色結(jié)果

討 論

TGF－β1是多功能的轉(zhuǎn)化生長因子，其生物作用依據(jù)細(xì)胞類型和環(huán)境而發(fā)生變化。它在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長分化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成及貯存、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、骨骼重建和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮著十分重要的作用。目前大量實(shí)驗(yàn)表明TGF－β1可以通過多種途徑促進(jìn)缺血缺氧性腦損傷所引起的神經(jīng)細(xì)胞的康復(fù)，并在阿爾茨海默病、帕金森病、AIDS腦病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［9－10］。但是外源性TGF－β1相對(duì)分子質(zhì)量較大，不易通過血腦屏障到達(dá)中樞。經(jīng)鼻給藥作為一種無創(chuàng)的，非侵入性的，相對(duì)比較方便的途徑可使藥物分子通過嗅部黏膜沿包繞在嗅神經(jīng)束周圍的連接組織或嗅神經(jīng)元軸突到達(dá)腦脊液或腦部，因而可繞過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮治療作用。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)鼻TGF－β1可以在迅速進(jìn)入嗅球、紋狀體、丘腦和大腦皮層等腦區(qū)［11］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦細(xì)胞外環(huán)境的控制中起關(guān)鍵作用，具有限制胞外鉀離子和興奮性氨基酸谷氨酸鹽堆積的作用?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞在其分子、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)及功能學(xué)方面會(huì)發(fā)生改變，包括:(1)降低了鉀離子通道(Kir4.1)和水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)的表達(dá)，損害了膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦組織內(nèi)鉀離子的緩沖能力，促使神經(jīng)元興奮閾值降低，增加同步化放電和突觸的可塑性，最終使神經(jīng)元去極化，同時(shí)可激活N－甲基－D－天冬氨酸(NMDA)受體等;(2)使谷氨酸鹽的代謝受阻，膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)谷氨酸鹽受體，并能促進(jìn)谷氨酸鹽的吸收和代謝，活化的膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸鹽清除能力降低，造成谷氨酸鹽蓄積可使細(xì)胞的興奮性增加。導(dǎo)致神經(jīng)元同步去極化放電及自發(fā)性癲癇發(fā)作;(3)降低縫隙連接，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過彼此縫隙連接共同形成大的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)以促進(jìn)對(duì)腦內(nèi)小分子蛋白的緩沖能力［12－14］，活化的膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)蛋白的緩沖能力降低。同時(shí)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可增加血腦屏障的滲透性，促使血液中鉀離子滲透入腦組織，鉀離子的蓄積本身可以作為癲癇發(fā)作的一個(gè)誘因［13］，所以星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活可增加神經(jīng)元的興奮性，癲癇的易感性。因此抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)量，可使神經(jīng)元的興奮性降低并可在一定程度上改善血腦屏障的通透性。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中固有的免疫源性細(xì)胞和免疫監(jiān)視細(xì)胞并在免疫炎癥反應(yīng)中起著重要作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腫瘤、外傷、中毒等情況下小膠質(zhì)細(xì)胞可快速激活，表現(xiàn)為阿米巴樣，吞噬死亡的細(xì)胞，并釋放生長因子促進(jìn)組織恢復(fù)。但過量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌和釋放如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、氧自由基、NO、IL－1β、TNF－α等炎癥因子和神經(jīng)毒性因子，并激活經(jīng)典和旁路補(bǔ)體途徑，可導(dǎo)致腦氧化應(yīng)激，神經(jīng)毒性，神經(jīng)元損傷、破壞和死亡，同時(shí)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化［15］。目前大量實(shí)驗(yàn)表明炎性因子可直接誘導(dǎo)癲癇的發(fā)作［16］，因此活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可直接損害腦神經(jīng)細(xì)胞并可間接促進(jìn)神經(jīng)元的興奮性。本實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)鼻滴入TGF－β1可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過量活化，14 d達(dá)到高峰，同時(shí)癲癇持續(xù)狀態(tài)后14 d時(shí)尼氏染色顯示存活神經(jīng)元較Pilo組明顯增加，因此我們認(rèn)為與TGF－β1抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。同樣在缺血缺氧性腦損傷的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中亦觀察到TGF－β1可顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［17］。因此TGF－β1通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可以改善腦組織炎癥因子和神經(jīng)毒性因子的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)鼻滴入TGF－β1有效降低了自發(fā)性癲癇發(fā)作，抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化和阻止了癲癇所引起的神經(jīng)元死亡，同時(shí)我們認(rèn)為TGF－β1抑制慢性期自發(fā)性癲癇的發(fā)作和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用是通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化實(shí)現(xiàn)的。

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