余 紅， 石明雋， 肖 瑛， 劉瑞霞， 王圓圓， 郭 兵， 張國(guó)忠

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550004)

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)和糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Snail1表達(dá)上調(diào)［1］，以siRNA抑制Snail1表達(dá)后，腎小管上皮細(xì)胞上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)標(biāo)志蛋白表達(dá)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)［2］。并且有研究表明Snail1在人IgA腎病和糖尿病腎病患者腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)增多［3］，提示Snail1促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT，參與了糖尿病腎損傷的病理過程。但對(duì)DN時(shí)Snail1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制認(rèn)識(shí)還十分有限。最近研究報(bào)道，DN腎小管上皮細(xì)胞EMT過程常常伴有蛋白激酶B(Akt)和糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK－3β)的激活或異常表達(dá)［4，5］，提示它們參與了 DN 的發(fā)病機(jī)制。本研究旨在觀察Snail1、Akt和GSK－3β在高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)變化，分析Akt/GSK－3β途徑與Snail1表達(dá)的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

1.1 主要抗體和試劑 兔抗大鼠Akt1單克隆抗體、小鼠抗大鼠β－actin單克隆抗體、鏈親和素－生物素－過氧化物酶(SABC)試劑盒、生物素標(biāo)記羊抗兔或羊抗小鼠IgG－HRP和兔抗羊IgG－HRP(武漢Boster);兔抗大鼠p－Akt(Ser473)多克隆抗體和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);兔抗大鼠p－GSK－3β(Ser9)多克隆抗體(Cell Signal);羊抗大鼠GSK－3β多克隆抗體和羊抗大鼠Snail1多克隆抗體(Santa Cruz);低糖DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;Gibco);轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma);LY294002(Calbiochem);總RNA提取試劑盒、蛋白質(zhì) marker、2×Taq PCR MasterMix和600 bp DNA marker(天根);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)。PVDF膜、3 mm Whatman濾紙(Millipore)。

1.2 動(dòng)物 雄性SD大鼠，清潔級(jí)，鼠齡20 d，體重(40±10)g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 大鼠原代腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)的培養(yǎng)和鑒定 大鼠乙醚麻醉后股動(dòng)脈放血處死。無(wú)菌取腎后，除去腎髓質(zhì)部分，分離、剪碎腎皮質(zhì)并置于80目、100目不銹鋼網(wǎng)篩過濾，分離腎小管節(jié)段。加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化30 min，1 000 r/min離心，棄上清。加入含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。置孵育箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)。72 h后全量更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d換1次培養(yǎng)液。第5～6 d細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)瓶底面積的80% ～90%時(shí)以0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶消化液消化、傳代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CK－18和α－SMA表達(dá)，鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞［2］。取第3代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約90%時(shí)，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步將細(xì)胞分為:(1)對(duì)照組:DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS培養(yǎng);(2)高滲組:20 mmol/L D－mannitol+DMEM+2%FBS培養(yǎng);(3)高糖組:20 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培養(yǎng)，分別在30 min、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和 72 h 收集細(xì)胞提取蛋白和RNA;(4)LY294002抑制劑組:LY294002稀釋為 25 μmol/L，預(yù)處理細(xì)胞 50 min，再以 25 μmo/L LY294002+DMEM+2%FCS+20 mmo/L D－glucose 5 mL培養(yǎng)細(xì)胞24 h。24 h后收集細(xì)胞蛋白。每一實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3次。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué) 細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X－100打孔，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后，分別加入抗 CK－18(1∶100)和抗 α－SMA(1∶200)抗體，4 ℃孵育過夜，加入生物素化Ⅱ抗，室溫下孵育40 min。DAB顯色。PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。

2.4 RT－PCR 按照試劑盒說明提取原代培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板擴(kuò)增 Snail1、Akt1、GSK－3β 和 β－actin，天根公司2×Taq MasterMix試劑盒行PCR擴(kuò)增。引物由上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 5 min預(yù)變性，94℃ 45 s變性，45 s退火，70℃ 45 s延伸，72℃ 10 min總延伸。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析擴(kuò)增產(chǎn)物的積分吸光度值，以目標(biāo)產(chǎn)物/β－actin積分吸光度比值表示靶基因的相對(duì)水平。

2.5 Western blotting 加 RIPA 裂解液 100 μL，12 000 r/min，4℃離心20 min，取上清。BCA法測(cè)蛋白濃度，加樣緩沖液變性蛋白，上樣，SDS－PAGE凝膠垂直電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，含0.05%Tween 20 的 TBS(TBS－T)沖洗后，分別以 anti－Snail1(1∶300)、anti－Akt1(1∶200)、anti－p－Akt(1∶300)、anti－GSK－3β(1∶300)、anti－p－GSK－3β(1∶300)和anti－β－actin抗體(1∶300)與PVDF膜4℃孵育過夜。加入用含1%脫脂牛奶的TBS－T稀釋辣根過氧化物酶連接的相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和分析，以β－actin蛋白條帶作內(nèi)參照，計(jì)算靶蛋白條帶與βactin蛋白條帶灰度的百分比值作為靶蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件Table 1.Sequences and conditions of the primers used in PCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 大鼠原代腎小管上皮細(xì)胞鑒定

倒置顯微鏡下可見，從培養(yǎng)24 h開始，卵圓形上皮樣細(xì)胞圍繞接種的腎小管節(jié)段呈島嶼狀長(zhǎng)出，約第3～4 d形成集落，形態(tài)呈典型的多邊鵝卵石樣。經(jīng)胰酶消化傳代后，腎小管上皮細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞貼壁并呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，符合上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿CK18蛋白表達(dá)陽(yáng)性，α－SMA蛋白表達(dá)陰性，說明培養(yǎng)細(xì)胞為腎小管上皮細(xì)胞。

2 高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)原代腎小管上皮細(xì)胞Snail1、Akt1和GSK－3β mRNA的表達(dá)

在原代培養(yǎng)的RTECs，正常糖對(duì)照組Snail1和Akt1 mRNA少量表達(dá)，高糖刺激30 min即可檢測(cè)到Snail1和Akt1 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增多，差異顯著，并隨高糖刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。高滲組和正常糖組比較，Snail1、Akt1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異。高糖刺激后GSK－3β mRNA的表達(dá)與正常糖和高滲組比較無(wú)顯著差異，見圖1。

Figure 1.Expression of Snail1，Akt1 and GSK－3β mRNA detected by RT－PCR in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated in normal－glucose(control，C)，mannitol(M)and high－glucose(HG)media at different time points.±s.n=3.*P ＜ 0.01 vs C.圖1 Snail1、Akt1和GSK－3β mRNA在不同處理組原代培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)

3 高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)原代腎小管上皮細(xì)胞Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和 p－GSK－3β蛋白的表達(dá)

Snail1蛋白在正常糖對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)，高糖培養(yǎng)后Snail1蛋白隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈遞增趨勢(shì)。從高糖培養(yǎng)30 min起Snail1蛋白表達(dá)即較正常糖對(duì)照組顯著增加，至72 h Snail1蛋白表達(dá)雖有減少，但仍高于正常糖組。正常糖組Akt1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白有少量表達(dá)，高糖刺激30 min始腎小管上皮細(xì)胞三者表達(dá)均顯著增多，Akt1隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，而p－Akt和 p－GSK－3β蛋白于24 h達(dá)高峰，此后略有下降。高糖刺激對(duì)總GSK－3β蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響。各時(shí)點(diǎn)高滲組 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β 和 p－GSK－3β蛋白的表達(dá)與正常糖組比較無(wú)明顯差異，見圖2。

Figure 2.Expression of Snail1，Akt1，p－Akt，GSK－3β and p－GSK－3β proteins detedted by Western blotting in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated in normal－glucose(M)，mannitol and high－glucose(HG)media at different time points.±s.n=3.#P＜0.05，*P＜0.01 vs C.圖2 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK3β和p－GSK3β蛋白在不同處理組原代培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)

4 LY294002 處理對(duì) Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和p－GSK－3β蛋白表達(dá)的影響

在培養(yǎng)的RTECs，高糖刺激后Snail1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達(dá)明顯增加，LY294002處理組Snail1、p－Akt和p－GSK－3β表達(dá)較高糖組明顯減少。但LY294002對(duì)總Akt1和總GSK－3β蛋白的表達(dá)沒有顯著影響，見圖3。

Figure 3.Effects of LY294002，a PI3K inhibitor，on Snail1，Akt1，p－Akt，GSK－3β and p－GSK－3β protein expression in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated with high glucose.The protein expression was examined by Western blotting assay.C:control;HG:high glucose;In:LY294002+high glucose.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs C;##P ＜0.01 vs HG.圖3 LY294002對(duì)高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和p－GSK－3β蛋白表達(dá)的影響

5 相關(guān)性分析

對(duì)體外培養(yǎng)各組腎小管上皮細(xì)胞中Snail1蛋白與p－Akt和p－GSK－3β蛋白的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Snail1蛋白表達(dá)分別和p－Akt、p－GSK－3β 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.794，P ＜0.01;r=0.755，P ＜0.01)。

討 論

我們利用原代腎小管上皮細(xì)胞研究高血糖引起腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制，相對(duì)于細(xì)胞株，原代腎小管上皮細(xì)胞直接來源于機(jī)體組織，更接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，其形態(tài)符合小管上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK－18蛋白表達(dá)陽(yáng)性，且未見間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α－SMA表達(dá)，證實(shí)我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞為腎小管上皮細(xì)胞。研究以相同滲透壓的甘露醇為對(duì)照，排除滲透壓變化的影響，動(dòng)態(tài)觀察不同培養(yǎng)條件和不同時(shí)點(diǎn)相關(guān)指標(biāo)的變化與高血糖狀態(tài)的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)30 min腎小管上皮細(xì)胞Snail1蛋白表達(dá)開始增加，至24 h時(shí)都維持于較高水平，48 h和72 h后表達(dá)有所下降，但表達(dá)量仍然明顯高于對(duì)照組。Snail1 mRNA也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。這提示Snail1基因在正常腎組織中保持沉默，而在糖尿病時(shí)異常激活，通過蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用。與本課題組前期的發(fā)現(xiàn)及其他學(xué)者的報(bào)道一致［1，3］。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)各時(shí)點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞Snail1蛋白表達(dá)上調(diào)同時(shí)伴有Akt1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達(dá)的增加以及Akt1 mRNA的表達(dá)增加，而高滲透壓對(duì)這些指標(biāo)沒有影響。這說明，糖尿病時(shí)，引起 Snail1、Akt1、p－Akt和p－GSK－3β 蛋白或mRNA表達(dá)改變的主要原因并非高滲透壓，而是高血糖本身;高糖不僅能上調(diào)Akt1總蛋白的表達(dá)，同時(shí)還激活A(yù)kt信號(hào)分子，但高糖并不影響總GSK－3β蛋白的表達(dá)水平，只是使其功能狀態(tài)發(fā)生改變。這種改變可能是高糖激活 Akt后，進(jìn)而使GSK－3β磷酸化失活的結(jié)果。

Snail1 mRNA于高糖刺激2 h開始有意義增高，晚于蛋白的增高，提示高糖引起Snail1蛋白表達(dá)上調(diào)不僅是通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，還存在其它調(diào)節(jié)機(jī)制。最近對(duì)肝細(xì)胞癌、皮膚癌等腫瘤的研究表明，Snail1的表達(dá)可能受到Akt/GSK－3β介導(dǎo)的翻譯后機(jī)制調(diào)節(jié)?；罨腁kt能與 GSK－3β結(jié)合，誘導(dǎo) GSK－3β向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，磷酸化其N端的Ser9活性位點(diǎn)使之失活。無(wú)活性的p－GSK－3β使Snail1泛素化降解減少，核移位增加，促進(jìn)EMT標(biāo)志蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［6－9］。我們觀察到，高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞Snail1蛋白過表達(dá)同時(shí)伴有p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達(dá)的增加。而最近研究也報(bào)道，Akt信號(hào)分子及其下游GSK－3β磷酸化后活性改變，與TGF－β1等因素誘導(dǎo)的腎纖維化中腎小管EMT過程有關(guān)［10－11］。那么，在糖尿病腎間質(zhì)纖維化損害中，是否Akt/GSK－3β信號(hào)通路也參與了Snail1表達(dá)的調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT?我們以LY294002處理高糖培養(yǎng)的RTECs。LY294002為Akt上游信號(hào)分子磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)的特異性抑制劑，以往研究表明，LY294002可通過特異的競(jìng)爭(zhēng)性抑制PI3K p110亞基的ATP結(jié)合位點(diǎn)而抑制PI3K的催化活性，進(jìn)而抑制Akt的激活。以LY294002處理后，高糖培養(yǎng)的RETCs p－Akt蛋白、p－GSK－3β及Snail1蛋白表達(dá)均減少，但總Akt1和GSK－3β蛋白的表達(dá)不受影響。而且，相關(guān)性分析顯示，Snail1蛋白的表達(dá)不僅與p－Akt蛋白表達(dá)高度正相關(guān)，也與p－GSK－3β蛋白表達(dá)正相關(guān)。這一結(jié)果提示，高糖條件下，Akt可能通過PI3K依賴的方式被激活，進(jìn)而使 GSK－3β磷酸化失功能，Snail1降解減少，促進(jìn)了Snail1表達(dá)上調(diào)。最近Lee等［5］分別以Akt抑制劑和GSK－3β抑制劑處理高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，Akt抑制劑逆轉(zhuǎn)高糖引起的GSK－3β磷酸化失活，GSK－3β活性受到抑制劑抑制后，則出現(xiàn)Snail1蛋白的蓄積和EMT，與我們的結(jié)果相似。

綜上所述，我們推測(cè)高糖可能經(jīng)Akt/GSK－3β途徑使腎小管上皮細(xì)胞Snail1蛋白水平上調(diào)。因此，DN時(shí)可能存在Akt/GSK－3β/Snail1的功能軸，通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腎纖維化。

［1］ 方開云，張國(guó)忠，婁晶磊，等.鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1在糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(4):737－742.

［2］ 方開云，石明雋，肖 瑛，等.Snail1 siRNA對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25(12):2424－2429.

［3］ Ohnuki K，Umezono T，Abe M，et al.Expression of transcription factor Snai1 and tubulointerstitial fibrosis in progressive nephropathy［J］.J Nephrol，2012，25(2):233－239.

［4］ Hao J，Liu S，Zhao S，et al.PI3K/Akt pathway mediates high glucose－induced lipogenesis and extracellular matrix accumulation in HKC cells through regulation of SREBP－1 and TGF－β1［J］.Histochem Cell Biol，2011，135(2):173－181.

［5］ Lee YJ，Han HJ.Troglitazone ameliorates high glucose－induced EMT and dysfunction of SGLTs through PI3K/Akt，GSK－3β，Snail1，and β－catenin in renal proximal tubule cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(5):F1263－F1275.

［6］ Maseki S，Ijichi K，Tanaka H，et al.Acquisition of EMT phenotype in the gefitinib－resistant cells of a head and neck squamous cell carcinoma cell line through Akt/GSK－3β/Snail signalling pathway［J］.Br J Cancer，2012，106(6):1196－1204.

［7］ El Touny LH，Banerjee PP.Akt GSK－3 pathway as a target in genistein－induced inhibition of TRAMP prostate cancer progression toward a poorly differentiated phenotype［J］.Carcinogenesis，2007，28(8):1710－1717.

［8］ Zhou BP，Deng J，Xia W，et al.Dual regulation of Snail by GSK－3β－mediated phosphorylation in control of epithelial－mesenchymal transition［J］.Nat Cell Biol，2004，6(10):931－940.

［9］ Wu Y，Zhou BP.TNF－α/NF－κB/Snail pathway in cancer cell migration and invasion［J］.Br J Cancer，2010，102(4):639－644.

［10］ Kattla JJ，Carew RM，Heljic M，et al.Protein kinase B/Akt activity is involved in renal TGF－β1－driven epithelial－mesenchymal transition in vitro and in vivo［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，295(1):F215－F225.

［11］ Li YJ，Tan XY，Dai CS，et al.Inhibition of integrin－linked kinase attenuates renal interstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(9):1907－1918.