邢衛(wèi)杰， 蔡柳洪， 李 予， 王文軍， 麥美琪， 楊冬梓， 張清學(xué)△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院不育與性醫(yī)學(xué)科，廣東廣州510630;2中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖中心，廣東廣州510120)

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，許多腫瘤、嚴(yán)重血液病或者自身免疫性疾病得到了治愈，但是女性的卵巢功能卻由于化學(xué)或物理治療而遭到嚴(yán)重?fù)p害或衰竭，這使得卵巢功能的保護(hù)和生育能力的保存越來(lái)越受到重視[1]。目前研究最多的是卵巢組織冷凍保存與移植。盡管有很多實(shí)驗(yàn)表明，移植后的卵巢可以在宿主動(dòng)物體內(nèi)生存并且有卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，但是還有許多問(wèn)題有待解決，比如:缺血再灌注損傷，它是移植后卵巢組織存活最大的威脅[2]。為探索減輕缺血再灌注損傷的方法，本實(shí)驗(yàn)在大鼠卵巢組織自體移植中使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，初步探討其在卵巢組織自體移植中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1 動(dòng)物及分組

健康成熟未交配過(guò)的清潔級(jí)雌性Sprague－Dawley(SD)大鼠，鼠齡70～80 d，體重190 ～220 g。給予標(biāo)準(zhǔn)光照(14 h光照、10 h黑夜)、室內(nèi)溫度(20±2)℃、濕度40% ～50%、標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。20只大鼠隨機(jī)分為2組:新鮮卵巢移植組(A組):10只，去勢(shì)后自體異位移植新鮮卵巢組織;新鮮卵巢移植加VEGF組(B組):10只，去勢(shì)后自體異位移植新鮮卵巢組織，在移植前放入含0.1 μg VEGF(DSL)的5 mL PBS中浸泡5 min，而且移植手術(shù)后第1 d開(kāi)始在移植物局部注射VEGF 0.2 μg，連用5 d。

2 方法

SD大鼠麻醉成功后固定，腹部剪毛，依次使用Ⅲ型安爾碘和75%乙醇消毒腹部皮膚，鋪消毒洞巾。取下腹恥骨聯(lián)合上1 cm做縱形切口，切口長(zhǎng)約2～3 cm，進(jìn)入腹腔。依次找出子宮、雙側(cè)輸卵管和卵巢，暴露雙側(cè)卵巢，小心切除雙側(cè)卵巢及部分輸卵管組織，結(jié)扎殘端并充分止血。將獲得的卵巢組織立即放入備好的PBS緩沖液中(B組獲得的卵巢組織放入含0.1 μg VEGF的5 mL PBS中，在常溫下浸泡5 min)，在解剖顯微鏡下去除多余的脂肪組織、結(jié)締組織和部分輸卵管，游離出卵巢組織。用眼科剪把卵巢組織剪成約1 mm×1 mm×2 mm大小的組織塊，部分置于10%甲醛固定以備做病理切片，部分做新鮮移植，移植時(shí)將處理好的新鮮卵巢組織包埋于腹部切口兩側(cè)的皮下與肌層之間，然后75%乙醇消毒皮膚，以絲線間斷縫合關(guān)腹。術(shù)后3 d使用青霉素肌肉注射抗感染。

3 觀察指標(biāo)

3.1 SD大鼠的動(dòng)情周期 各組SD大鼠自卵巢移植后，每日上午行陰道脫落細(xì)胞涂片，用小棉簽蘸生理鹽水涂陰道脫落細(xì)胞于載玻片上，晾干后用堿性美蘭液(美蘭3.0 g、95%乙醇30 mL、10%氫氧化鈉0.1 mL和蒸餾水100 mL)中浸泡5 min，用清水沖洗后晾干，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)角化細(xì)胞的比例來(lái)了解動(dòng)情周期的情況[2]。

3.2 組織形態(tài)學(xué) SD大鼠行卵巢組織移植后飼養(yǎng)4周。麻醉后切開(kāi)腹部皮膚，觀察移植的卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育情況及周圍血供情況，并完整剝離移植物，放入10%甲醛液中保存，以作病理切片行組織學(xué)檢查。

各級(jí)卵泡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)是[3]:始基卵泡:單層梭形前顆粒細(xì)胞包繞1個(gè)處于減數(shù)分裂雙線期的初級(jí)卵母細(xì)胞;初級(jí)卵泡:1層立方形顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞;次級(jí)卵泡:2層或2層以上的立方形的顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞;竇卵泡:有多層顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞，并有卵泡腔的形成。按 Gougeon[4]的標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)正常的卵泡表現(xiàn)為:完整的卵母細(xì)胞，內(nèi)見(jiàn)圓形細(xì)胞核及清晰的核仁，周圍包繞的顆粒細(xì)胞排列規(guī)則，核無(wú)濃縮。形態(tài)學(xué)異常的卵泡表現(xiàn)為:卵泡結(jié)構(gòu)不完整或消失，卵母細(xì)胞皺縮，卵母細(xì)胞核固縮，顆粒細(xì)胞排列紊亂。

3.3 血清中的雌二醇水平 SD大鼠行卵巢組織移植后，飼養(yǎng)4周。在取卵巢組織的同時(shí)取下腔靜脈血約3 mL，用低溫離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，血清用放免試劑盒(DSL)測(cè)雌二醇水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有5只大鼠因麻醉意外、感染等死亡，其中A組3只、B組2只。

1 動(dòng)情周期的恢復(fù)率

A組7只SD大鼠中共有6只恢復(fù)動(dòng)情周期，動(dòng)情周期恢復(fù)率為85.7%，有1只大鼠雖沒(méi)有恢復(fù)動(dòng)情周期，但是從其陰道脫落細(xì)胞涂片分析，角化細(xì)胞比例＞50%，可以視為受雌激素影響，在一定程度上，可以認(rèn)為已經(jīng)恢復(fù)卵巢功能;B組中8只SD大鼠全部恢復(fù)動(dòng)情周期，動(dòng)情周期恢復(fù)率為100%。

2 移植4周后SD大鼠卵巢組織的大體標(biāo)本觀察

2.1 A組 移植4周后取標(biāo)本時(shí)，移植物體積比移植前明顯增大，移植前卵巢組織平均體積為(1.36±0.61)mm3，4 周后移植物平均體積為(13.30 ±7.19)mm3。移植物與周圍組織邊界清晰，表面可見(jiàn)細(xì)小的血管從周圍組織中長(zhǎng)入卵巢組織中。體積計(jì)算公式為:長(zhǎng) × 寬 × 高 ×0.52。

2.2 B組 移植4周后取標(biāo)本時(shí)，移植物體積比移植前明顯增大，移植前卵巢組織平均體積為(1.46±0.49)mm3，4 周后移植物平均體積為(40.04 ±30.46)mm3。移植物表面布滿細(xì)小的血管，呈鮮紅色，從表面偶可見(jiàn)到透明狀囊性小卵泡，周圍組織血供豐富。

比較移植前后的卵巢組織體積以及A組和B組移植后的卵巢組織體積大小，發(fā)現(xiàn)體積大小的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 卵巢組織移植前后的體積比較Table 1.The comparison of ovarian size in the two groups before and after transplantation(±s)

表1 卵巢組織移植前后的體積比較Table 1.The comparison of ovarian size in the two groups before and after transplantation(±s)

*P ＜0.05 vs group A.

Group n Before transplantation(mm3)After transplantation(mm3)A 7 1.36 ±0.61 13.30 ±7.19 B 8 1.46 ±0.49 40.04 ±30.46*

3 新鮮卵巢組織移植后4周的形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下:A組和B組中，均可見(jiàn)到正常形態(tài)的始基卵泡和生長(zhǎng)卵泡(初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇前卵泡和竇卵泡)。形態(tài)學(xué)正常的卵泡均有完整的卵母細(xì)胞，內(nèi)見(jiàn)圓形的細(xì)胞核及清晰的核仁，周圍包繞的顆粒細(xì)胞排列規(guī)則，核無(wú)濃縮。偶可見(jiàn)到異常形態(tài)的卵泡，見(jiàn)圖1。

每個(gè)標(biāo)本觀察10個(gè)高倍鏡視野，對(duì)各級(jí)卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后分別計(jì)算出各組中形態(tài)正常的卵泡所占比例，見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各級(jí)正常形態(tài)卵泡所占的比例在2組之間的差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從表2可以看出，B組中移植后正常形態(tài)的竇卵泡所占比例與A組移植后相比有增高趨勢(shì)。

Figure 1.Normal follicles in the two groups(×400).A:primordial follicles，with one layer of flattened granulosa cells around the oocyte(group A);B:primary follicles，with one layer of cuboidal granulosa cells around the oocyte(group A);C:secondary follicles，with two or more layers of cuboidal granulosa cells around the oocyte(group B);D:antral follicles，with an antral cavity formed as a result of coalescence of the fluidfilled spaces(group A).圖1 2組中形態(tài)正常的卵泡

表2 2組正常形態(tài)卵泡所占比例Table 2.The proportion of normal follicles in the two groups(%.±s)

表2 2組正常形態(tài)卵泡所占比例Table 2.The proportion of normal follicles in the two groups(%.±s)

Classification of follicles Group A(n=7)Group B(n=8)Before transplantation After transplantation Before transplantation After transplantation Primordial follicle 91.42 ±8.66 82.14 ±23.7886.76 ±17.74 82.29 ±20.14 Primary follicle 86.43 ±24.58 80.95 ±24.40 78.75 ±24.75 81.21 ±12.82 Secondary follicle 91.45 ±10.97 84.49 ±20.54 90.63 ±18.60 81.73 ±16.06 Antral follicle 98.21 ±4.72 79.29 ±17.84 96.88 ±8.84 80.21 ±18.86

4 卵巢組織移植4周后血清雌二醇的測(cè)定結(jié)果

A組雌二醇平均水平為 (6.64±2.53)ng/L;B組雌二醇平均水平為(10.70±3.10)ng/L，2組的雌二醇水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

討 論

1 缺血再灌注損傷對(duì)卵巢組織移植的影響

卵巢組織移植過(guò)程中的卵泡丟失與移植物局部缺血缺氧的持續(xù)時(shí)間，即血管長(zhǎng)入移植物所用的時(shí)間有關(guān)，受血管生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)。有學(xué)者認(rèn)為:缺血再灌注損傷是移植后卵巢組織存活的最大威脅，由于存在缺血再灌注損傷，移植后卵巢組織的體積比移植前縮小30%～70%，并且卵巢組織出現(xiàn)明顯的纖維化，嚴(yán)重影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育及卵巢功能的恢復(fù)。有研究表明竇前卵泡死亡主要是由于缺血再灌注損傷造成，而不是由于冷凍損傷本身[5]。因此，怎樣有利于血管生成以及避免缺血再灌注損傷成為移植中的關(guān)鍵問(wèn)題。

2 VEGF的生理作用

為了找出減少缺血再灌注損傷的方法，有學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了一些研究。Schnorr等[6]用猴子做實(shí)驗(yàn)，卵巢自體移植后應(yīng)用VEGF，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中卵巢功能恢復(fù)的比例沒(méi)有顯著差別，但是在卵巢功能恢復(fù)的猴子中，使用VEGF的猴子體內(nèi)激素水平比不使用VEGF的激素水平顯著升高，說(shuō)明VEGF對(duì)促進(jìn)移植后卵巢功能的恢復(fù)有一定的作用。VEGF是高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是血管生成開(kāi)關(guān)的主要成分，它作用最強(qiáng)大，可能是最初起始血管生成一系列反應(yīng)的信號(hào)因子，具有以下幾種功能:(1)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;(2)增加微血管通透性;(3)改變細(xì)胞外基質(zhì);(4)維持血管生成等作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:VEGF及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1(TGF－β1)等的存在有助于提高血管長(zhǎng)入的速度，促性腺激素可調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)血管生長(zhǎng)因子水平，從而可以促進(jìn)血管生成[7]。

3 VEGF對(duì)移植卵巢組織的作用

在大鼠卵巢組織移植實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，血管重建一般發(fā)生于移植后的48 h內(nèi)，需要的時(shí)間超過(guò)24 h，約有50%的始基卵泡由于缺血再灌注損傷而丟失[8]。另外有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):VEGF是在移植后早期(48 h內(nèi))對(duì)血管重建起關(guān)鍵作用，血管生長(zhǎng)因子(如:VEGF、TGF等)的合成應(yīng)在移植前達(dá)到有效濃度，并維持一定時(shí)間，以誘導(dǎo)新血管形成，減輕局部缺血缺氧的發(fā)生[7]。根據(jù)以上理論基礎(chǔ)，而且依據(jù)Schnorr等[6]的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的VEGF濃度，本實(shí)驗(yàn)中B組中大鼠的卵巢組織，在移植之前放入含有0.1 μg VEGF的5 mL PBS中浸泡，使其充分接觸VEGF，使VEGF在移植前達(dá)到有效濃度，而術(shù)后繼續(xù)局部注射VEGF使之維持在一定的濃度，以減少血管重建所需時(shí)間，進(jìn)而減輕由于缺血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成的卵泡丟失和卵巢組織的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):B組中SD大鼠的雌二醇水平明顯高于A組;A組和B組移植后的卵巢體積明顯大于移植前的卵巢體積，且B組移植后的卵巢體積明顯大于A組，其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此外，B組中移植后正常形態(tài)的竇卵泡所占比例與A組移植后相比有增高趨勢(shì)。肉眼觀察移植物，發(fā)現(xiàn)B組中的移植物表面布滿細(xì)小的新生血管，且B組中移植物周圍組織血供豐富，有許多小血管從周圍組織中長(zhǎng)入移植物中。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在卵巢組織移植過(guò)程中使用VEGF，可以減少因缺血再灌注而造成對(duì)卵巢組織的損傷，可以在一定程度上促進(jìn)卵巢組織功能的恢復(fù)。在以后的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)不同濃度梯度進(jìn)行分組，以找到VEGF的最佳濃度，使之發(fā)揮更好的促進(jìn)血管重建的作用。

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