張國華 徐杰 吳達榮 陶恩祥

研究表明，散發(fā)性帕金森病(Parkinson’s disease，PD)可能與遺傳因素和環(huán)境因素共同作用有關(guān)[1-2]，其中環(huán)境因素占了十分重要的地位。 魚藤酮作為一種環(huán)境毒素，和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四 氫 吡 啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)一樣能誘導大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元(dopamine，DA)受損、缺失，十分適合用于 PD 動物模型的制作[3]。

在PD治療方面，近年來被廣泛開展的外科治療近期療效不錯[4]，但只是治標不治本，遠期療效尚不確切。然而，如何阻止DA神經(jīng)元凋亡則被看作是根治PD的新方向。據(jù)報道，利福平除具有抗結(jié)核等作用外，還具有抗氧化應(yīng)激及抗神經(jīng)元凋亡的作用，從而提示利福平可能具有治療PD的作用[5]。我們之前的研究已證實，利福平在體外和體內(nèi)均具有保護DA神經(jīng)元的作用[6-7]，但利福平在體內(nèi)保護神經(jīng)元的作用是否通過對抗細胞凋亡而實現(xiàn)卻還沒明確。

本實驗是在上述的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，通過魚藤酮誘導 Sprague-Dawley(SD)大鼠出現(xiàn) DA神經(jīng)元的凋亡，從而觀察利福平在活體內(nèi)的抗神經(jīng)元凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性SD大鼠72只(清潔級，中山大學實驗動物中心提供)，體質(zhì)量250～300 g。將大鼠隨機分成五組，正常對照組及利福平(MD公司)對照組各12只，魚藤酮(Sigma公司)組、利福平治療組及利福平預(yù)防組各16只。正常對照組、利福平對照組及魚藤酮組分別每天給予背部皮下注射葵花油(Sigma 公司)1 mL／(kg·d)、利福平灌胃及背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液；利福平治療組在給予魚藤酮1周后開始同時給予魚藤酮和利福平；利福平預(yù)防組在給予魚藤酮的前3 d每天先給予利福平灌胃，然后每天同時給予魚藤酮和利福平。以上各組總的處理時間均為3周；魚藤酮在葵花油乳化液中的濃度為1.5 mg／mL，給藥劑量為1.5 mg／(kg·d)； 利福平在生理鹽水中的濃度為 5 mg／mL，給藥劑量為 30 mg／(kg·d)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠處死及標本采集 于第3周末分別處死各組大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注冰鹽水100 mL，持續(xù)灌注冰4%多聚甲醛-PBS100 mL，斷頭取腦，4%多聚甲醛-PBS固定過夜，冠狀切斷包含黑質(zhì)的腦組織(前囟尾側(cè)4.6～6.2 mm)，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.2.2 原位末端標記法(Tunel)(R＆D 公司)檢測凋亡 中腦石蠟切片脫蠟回水，NeuroPore室溫處理后去DNA酶水漂洗，陽性對照組用TACS核酸酶孵育30 min，室溫下抑制5 min，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)標記緩沖液5 min，標記反應(yīng)混和液37℃孵育1 h，TdT終止緩沖液室溫下5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，鏈霉親和素-辣根過氧化物(DAB)酶室溫下10 min復(fù)染，脫色，封片，光鏡下觀察黑質(zhì)區(qū)凋亡情況。

1.2.3 黑質(zhì) Bax、Bcl-2 和 Caspase3 免疫組化檢測切片脫蠟回水后微波熱修復(fù)抗原，辣根過氧化物酶(HRP)阻斷劑阻斷30 min，分別4℃孵育兔抗鼠Caspase-3 多克隆抗體(Chemicon 公司)(1∶100)、兔抗鼠 Bax 多克隆抗體(Santa Cruz公司)(1∶100)、兔抗鼠 Bcl-2 多克隆抗體(Santa Cruz 公司)(1∶100)過夜，HRP 標記羊抗兔二抗(Boster公司)(1∶100)室溫孵育2 h，DAB顯色，復(fù)染，脫水、透明、烘干，中性樹膠封片后鏡下觀察。

1.2.4 圖像分析 經(jīng) Tunel及 Bax、Bcl-2和 Caspase-3免疫組化染色后的切片(每組中5個大鼠同一層面的中腦黑質(zhì)切片)在Imagepro-Plus5.1系統(tǒng)下，每張切片取3個不同的視野進行Tunel及Bax、Bcl-2和Caspase-3陽性細胞數(shù)的計算，每一張Tunel染色切片放大400倍進行觀察和分析，每一張免疫組化染色切片放大200倍進行觀察和分析，陽性細胞計數(shù)的單位是個／mm2。

1.3 統(tǒng)計學方法 Tunel及 Bax、Bcl-2和 Caspase-3陽性細胞數(shù)均采用(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，5組大鼠以上4種陽性細胞數(shù)均數(shù)的比較均采用單因素方差分析，處理組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠中腦黑質(zhì)凋亡細胞數(shù)目的比較 如表1、圖1所示，Tunel檢測結(jié)果顯示，兩對照組的大鼠黑質(zhì)凋亡細胞數(shù)在統(tǒng)計學上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；與兩對照組相比，其余3組的大鼠黑質(zhì)凋亡細胞數(shù)均明顯增多，且有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，而黑質(zhì)凋亡細胞數(shù)在其余3組間的兩兩比較也均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。

表1 Tunel及 Bax、Bcl-2、Caspase3 陽性細胞數(shù)(400 ×，200 × )(個 ／mm2)

圖1 大鼠中腦黑質(zhì)凋亡細胞(Tunel，胞質(zhì)呈棕褐色為陽性)(400×)

圖2 大鼠中腦黑質(zhì)Bax、Bcl-2和Caspase3陽性細胞(DAB染色，胞質(zhì)呈棕褐色為陽性)(200×)

2.2 大鼠中腦黑質(zhì) Bax、Bcl-2和 Caspase-3的陽性細胞數(shù)的比較 如表1、圖2所示，兩對照組的大鼠黑質(zhì)的Bax、Bcl-2和Caspase-3陽性細胞數(shù)在統(tǒng)計學上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；與兩對照組相比，其余3組的大鼠黑質(zhì)Bax及Caspase-3陽性細胞數(shù)均明顯增多而Bcl-2陽性細胞數(shù)均明顯減少，且3組中的這3個指標均與兩對照組間有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，而這3個指標在其余3組中的兩兩比較也均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。

3 討論

近年來，隨著神經(jīng)生化技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)PD的發(fā)生與細胞凋亡存在密切關(guān)系。研究表明，各種因素導致的PD最終都經(jīng)過黑質(zhì)DA神經(jīng)元大量凋亡這一共同通路[8]。線粒體、氧化應(yīng)激及α-synuclein是整個凋亡過程中的關(guān)鍵因素。在PD患者黑質(zhì)DA神經(jīng)元內(nèi)，線粒體功能異常和氧化應(yīng)激可使α-synuclein發(fā)生異常聚集，而α-synuclein的異常聚集反過來影響線粒體的功能，從而形成惡性循環(huán)，最終導致細胞凋亡和PD的發(fā)生[9]。

在蛋白水平上，與PD細胞凋亡關(guān)系最為密切的是Bcl-2蛋白家族的Bcl-2(抑細胞凋亡)和Bax(促細胞凋亡)兩種蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Bcl-2和Bax的比值對凋亡的發(fā)生起到重要調(diào)節(jié)作用[10]。同時，在PD患者黑質(zhì)細胞發(fā)生凋亡的過程中caspase級聯(lián)反應(yīng)是必不可少的環(huán)節(jié)[11]。上述發(fā)現(xiàn)提示，黑質(zhì)DA神經(jīng)元凋亡的核心環(huán)節(jié)可能是各種因素的作用下導致Bcl-2和Bax的比例下降及Caspase-3的激活并最終引起細胞凋亡。

魚藤酮是一種人類容易少量長期接觸的環(huán)境毒素，其可直接通過血腦屏障抑制腦組織的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性[12]。由于DA神經(jīng)元對能量障礙特別敏感，因此低劑量的魚藤酮在不影響其他部位細胞線粒體功能的情況下卻可引起DA神經(jīng)元的凋亡[13]。另有研究顯示，魚藤酮最終通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的比例并激活caspase來誘導細胞凋亡[14]。

有學者提出，利福平之所以同時具有透過血腦屏障抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)細胞凋亡的作用，是由于其結(jié)構(gòu)式中有一個連有脂肪鏈的萘氫醌環(huán)[5]。利福平經(jīng)口服后在大鼠腦中濃度可達到血藥濃度的 13%[15]，能有效作用于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]。 而本課題組已通過實驗發(fā)現(xiàn)，利福平可在體外對抗MPP+誘導的PC12細胞凋亡[6]，但此作用在活體身上卻還沒得到證實。

在本研究中，我們選擇了魚藤酮來誘導SD大鼠出現(xiàn)中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元的大量凋亡，并同時應(yīng)用利福平經(jīng)胃給藥以抗凋亡，通過檢測凋亡細胞數(shù)及Bax、Bcl-2和Caspase-3的免疫活性變化以觀察利福平是否具有抑制魚藤酮誘導的細胞凋亡的作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①低劑量慢性暴露于魚藤酮后，大鼠黑質(zhì)的凋亡細胞明顯增多，而同時給予利福平灌胃的大鼠黑質(zhì)凋亡細胞比僅給予魚藤酮的大鼠明顯減少；②低劑量慢性暴露于魚藤酮后，大鼠黑質(zhì)部位Bax、Caspase-3表達增多而Bcl-2表達減少，而同時給予利福平灌胃的大鼠黑質(zhì)的上述變化均有所減輕；③預(yù)防性使用利福平所起的抗凋亡作用較治療性使用利福平更顯著。因此，我們得出以下結(jié)論：①魚藤酮在活體內(nèi)是通過誘發(fā)細胞凋亡途徑來引起DA神經(jīng)元的大量丟失的，而利福平則在活體內(nèi)具有對抗魚藤酮誘導的細胞凋亡的作用；②魚藤酮在活體內(nèi)通過下調(diào)Bcl-2和Bax的比值、激活caspase通路來誘導DA神經(jīng)元凋亡發(fā)生的，而利福平在活體內(nèi)可通過上調(diào)Bcl-2和Bax的比值、抑制caspase通路來實現(xiàn)抗魚藤酮誘導的細胞凋亡的作用；③應(yīng)用利福平的起始時間越早、持續(xù)時間越長，對抗細胞凋亡的作用越明顯。

總的來說，本研究不但成功地模擬了環(huán)境毒素(線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ)在活體內(nèi)誘發(fā)大量DA神經(jīng)元發(fā)生凋亡的過程，驗證了這類毒素引起細胞凋亡發(fā)生的通路，而且進一步證實了利福平具有抑制環(huán)境毒素誘導的多巴胺神經(jīng)元凋亡的作用，闡明了其抗凋亡作用的實現(xiàn)途徑。這些重要發(fā)現(xiàn)使利福平應(yīng)用于治療人類PD的想法由空想變成可能，為在PD的治療上獲得重大突破邁出了堅實的一步。

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