龍厚元 代偉 張?chǎng)H鵬 宋玉強(qiáng) 謝安木

血小板膜糖蛋白受體P2Y12(platelet membrane receptor P2Y12)在血小板聚集中發(fā)揮著特別重要的作用，在動(dòng)脈血栓形成中起到重要作用[1]。近年來(lái)探討血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性卒中的相關(guān)性已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。本項(xiàng)研究檢測(cè)血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因-T744C位點(diǎn)的多態(tài)性與缺血性卒中的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 病例組165例相互無(wú)血緣關(guān)系的缺血性卒中患者，其中男86例，女79例，平均年齡(66.06±7.93)歲。所有患者均為青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的缺血性卒中患者(入院時(shí)間為2011年5月至2012年5月)，并經(jīng)顱腦CT或MRI檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合全國(guó)第四屆腦血管病會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有心房纖顫的患者；②有外傷手術(shù)史的患者；③有血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、自身免疫疾病的患者；④有心、肺、肝、腎功能不全的患者。對(duì)照組152例，其中男81例，女 71例，平均年齡(64.5± 16.57)歲，均為青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心同期的健康體檢者，并行顱腦CT或MRI排除腦血管疾病。記錄臨床資料主要包括年齡，性別，高血壓，糖尿病，高脂血癥。高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)是按照衛(wèi)生部疾病控制局頒布的《2010年修訂版中國(guó)高血壓防治指南》的規(guī)定，并且除外繼發(fā)性高血壓。高脂血癥的診斷依據(jù)是中國(guó)成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會(huì)2007年制定的 《中國(guó)成人血脂異常防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病的診斷依據(jù)是美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)頒布的《2010年ADA糖尿病診療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法 病例組和對(duì)照組均禁食12 h后抽取外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，溶液型法提取基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP) 用 Primer-Premiers軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增-T744c多態(tài)位點(diǎn)引物上游5′-TTTGGGGAATTTAAGTGCTAC-3′，下游 5′-CCA-CAATAGGCCTATAATG-3′。引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL，Tap PCR MasterMix 5 μL，DNA 模板 1.0 μL，上下游引物各0.2 μL，超純水 3.6 μL。 用 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性30 s，58℃退火 36 s，72℃延伸 30 s，共 35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。待PCR反應(yīng)完成后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)含溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠電泳系統(tǒng)下確認(rèn)擴(kuò)增的252 bp片段為目的產(chǎn)物。

1.2.3 酶切反應(yīng) 酶切反應(yīng)體系總量10 μL，用TaiⅠ限制性內(nèi)切酶 0.5 μL、10X buffer 0.7 μL、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL，最后加超純水至10 μL進(jìn)行酶切，65℃水浴8 h。經(jīng)含溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，判斷基因型。酶切電泳結(jié)果(見(jiàn)圖1)，產(chǎn)物是163、89 bp的片段為CC型，252 片段為 TT 型，252、163、89 bp 的片段為 TC型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，病例組和對(duì)照組的計(jì)量資料采用(x±s)描述，計(jì)量資料數(shù)據(jù)分析采用方差分析；計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)分析采用卡方檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型分析影響缺血性卒中的相關(guān)因數(shù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

圖1 T744c酶切后產(chǎn)物

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 病例組和對(duì)照組間性別構(gòu)成、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.043，t＝-1.86，P﹥0.05)，但病例組和對(duì)照組間高血壓、糖尿病、高脂血癥比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝15.47，χ2＝ 10.29，χ2＝9.17，P﹤0.05或者 P﹤0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 病例組與對(duì)照組臨床資料比較

2.2 基因型和基因型頻率 病例組TC／CC基因型頻率(43.61%)明顯高于對(duì)照組的(28.95%)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝ 4.73，P﹤0.05)。C 等位基因頻率病例組為22.03%明顯高于對(duì)照組的 15.46%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝5.80，P﹤0.05)(見(jiàn)表2)。

2.3 多因素Logistic回歸分析 經(jīng)多因素Logistic回歸校正年齡、高血壓病、糖尿病、高脂血癥后，以健康對(duì)照組為參照系，相對(duì)于TT基因型，TC／CC型患缺血性卒中的相對(duì)危險(xiǎn)度為 1.65，95%CI：1.03～2.75，P＝0.04。

3 討論

研究證實(shí)通過(guò)激活Gi信號(hào)傳導(dǎo)通路可以引起血小板聚集導(dǎo)致血栓形成[3]。Gi信號(hào)傳導(dǎo)通路主要抑制血小板腺苷酸環(huán)化酶的活化，其傳導(dǎo)主要由P2Y受體中的 P2Y12受體介導(dǎo)[4]。血小板膜糖蛋白受體P2Y12是ADP受體兩個(gè)重要的止血及凝血介質(zhì)之一[3]，在 ADP與 P2Y12受體結(jié)合后，P2Y12受體與 Gi蛋白耦連[5]，同時(shí)刺激血小板顆粒分泌出血栓素A2，激活纖維蛋白原受體(糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受體)，從而使血小板的聚集[6]，因此血小板膜蛋白 P2Y12受體基因多態(tài)性可通過(guò)影響血小板的功能，導(dǎo)致血栓形成。

表2 病例組與對(duì)照組-T744c基因多態(tài)性分布頻率比較

研究證明血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因參與了敲除小鼠模型凝血機(jī)制環(huán)節(jié)的啟動(dòng)[7]，也有研究推測(cè)人類(lèi)該基因缺陷者凝血機(jī)制同樣也會(huì)出現(xiàn)障礙[8]，國(guó)外有研究證實(shí)了血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因多態(tài)性與動(dòng)脈血栓的形成有顯著的相關(guān)性[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因與血栓性疾病的關(guān)系及與氯吡格雷等藥物相關(guān)性研究較為普遍[9-10]，但于血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因位點(diǎn)多態(tài)性作為獨(dú)立因素影響缺血性卒中的研究仍然不夠完善，在缺血性卒中的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，病例組和對(duì)照組間性別構(gòu)成、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，而高血壓、糖尿病、高脂血癥比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05或者P﹤0.01)。由于CC型基因較少合并與TC型基因組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。病例組TC／CC行基因頻率(43.61%)明顯高于對(duì)照組的(28.95%)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝4.73，P﹤0.05)。C等位基因的頻率(22.03%)也明顯高于對(duì)照組的(15.46%)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝5.80，P﹤0.05)。經(jīng)多因素Logistic回歸校正年齡、高血壓病、糖尿病、高脂血癥后，以健康對(duì)照組為參照系相對(duì)于TT基因型，TC／CC型患腦卒中的相對(duì)危險(xiǎn)度為1.65。推測(cè)血小板膜糖蛋白受體P2Y12基因-T744C位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性卒中具有相關(guān)性，其TC／CC型可能是腦卒中患者易感危險(xiǎn)因素之一，其中等位基因C可能是缺血性卒中的致病因子。此外，本研究樣本量偏少可能會(huì)降低群體的代表性，不同人群的遺傳因素也存在差異，這種差異可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異。如果能進(jìn)行較大樣本、多種因素、多項(xiàng)指標(biāo)的綜合分析則能到得更完善的結(jié)論。

[1]Fontana P，Gaussem P，Aiach M，et al.P2Y12 H2 haplotype is associated with peripheral arterial disease： a case-control study[J].Circulation，2003，16，108(24)：2971-2973.

[2]全國(guó)第四屆腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議.各類(lèi)腦血管疾病診斷要點(diǎn)[J].中華神經(jīng)科雜志，1996，29(6)：380.

[3]Chang H，Yanachkov IB.Agonist and antagonist effects of diadenosine tetraphosphate，a platelet dense granule constituent，on platelet P2Y1，P2Y12 and P2X1 receptors[J].Thrombosis Research，2010，125(2)：159-165.

[4]Mousa SA，Jeske WP.Antiplatelet therapy prasugrel： a novel platelet ADP P2Y12 receptor antagonist [J].Clinical and applied thrombosis／hemostasis，2010，16(2)：170-176.

[5]Guidetti GF，Lova P. The G(i)-coupled P2Y12 Receptor Regulates Diacylglycerol-mediated Signaling in Human Platelets[J]. The Journal of Biological Chemistry，2008，283(43)：28795-28805.

[6]Sony SS，Miralkumar P，Charles K，et al.Two-pore potassium ion channels are inhibited by both Gq／11-and Gi-coupled P2Y receptors [J]. Molecular and cellular neurosciences，2010，43(4)：363-369.

[7]Kunapuli SP，Ding Z，Dorsam RT，et al.ADP receptors：targets for developing antithrombotic agents[J].Curt Pharm Des，2003，9(28)：2303-2316.

[8]Cattaneo M，Zighetti ML，Lombardi R，et al.Molecular bases of defective signal transduction in the platelet P2Y12 receptor of a patient with congenital bleeding [J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(4)：1978-1983.

[9]金海強(qiáng)，孫永安，黃一寧，等.氯吡格雷在缺血性血管疾病中的個(gè)體化應(yīng)用[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2012，38(1)：54-57.

[10]Grdini A，Vojvodi D，Ili V，et al.The importance of tests applied to evaluate the effectiveness of antiplatelet therapy in patients with recurrent coronary stent thrombosis[J].Vojnosanitetski Pregled，2009，66(4)：328-332.