鄧 姝 沈建平 沈一平 林圣云 胡致平 鄭智茵 周郁鴻

(浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，浙江省杭州市郵電路54號(hào)，310006)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞惡性腫瘤。目前，對(duì)于晚期、復(fù)發(fā)和耐藥MM患者的治療仍然是一個(gè)難題。已有研究表明三氧化二砷(As2O3)在體外能夠抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［1］本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究 As2O3聯(lián)合維生素 K3對(duì) RPMI8226細(xì)胞增殖與凋亡的影響，期望為臨床合理應(yīng)用As2O3，治療MM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226由本科室長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)從－80℃冰箱取出，快速?gòu)?fù)蘇后傳代培養(yǎng)備用。培養(yǎng)基為RPMI－1640培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)液:Sigma公司產(chǎn)品。小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品。四甲基噻唑氮藍(lán)(MTT，華美生物工程公司)，二甲亞砜(Sigma公司);Annexin－V－FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(深圳晶美公司)。As2O3注射液(黑龍江伊達(dá)藥業(yè)公司)，維生素K3(無(wú)錫第七制藥廠)，兩藥使用前均用不含血清的RPMI－1640稀釋至所需濃度。FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)所加藥物不同分為4組，依次為空白對(duì)照組、維生素K3組、As2O3組、維生素K3+As2O3組。細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/mL。在24孔培養(yǎng)板中分別加入2mL細(xì)胞懸液?？瞻讓?duì)照組加入培養(yǎng)液。維生素 K3組加入維生素 K3，濃度分別為2μmol/L，5μmol/L，10μmol/L。As2O3組加入 As2O3，使其終濃度為2μmol/L。維生素K3+As2O3組同時(shí)加入維生素K3和As2O3，各孔細(xì)胞懸液中As2O3的終濃度均為5μmol/L，維生素K3的終濃度分別為2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L(根據(jù)參考文獻(xiàn)及多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)。加藥后 12h、24h、48h、72h 收集細(xì)胞。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn) 用含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞配制成5×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，每孔200μL加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)。分別以不同的時(shí)間點(diǎn)和藥物濃度作為一組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔及1個(gè)對(duì)照孔，對(duì)照孔加入空白對(duì)照孔的細(xì)胞。然后每孔加入5mg/mL MTT 20μL，再培養(yǎng)4h，離心，棄上清，每孔加200μL二甲亞砜，振搖至結(jié)晶溶解后用酶聯(lián)儀測(cè)定吸光度A值(測(cè)試波長(zhǎng)600nm)。以該組復(fù)孔的平均值作為該組細(xì)胞的A值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1－(A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照)×100%。

1.3.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 藥物與RPMI8226細(xì)胞共同培養(yǎng)48h，每組收集1×106個(gè)細(xì)胞，70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇4℃固定過(guò)夜，加入RNA酶，37℃水浴消化15～30min 以上，加入 PI，4℃存放 20min，加入適量 PBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI標(biāo)記法檢測(cè)凋亡As2O3及維生素K3單獨(dú)及聯(lián)合作用RPMI8226細(xì)胞同上，實(shí)驗(yàn)按照說(shuō)明書(shū)操作，細(xì)胞周期檢測(cè)藥物與RPMI8226細(xì)胞共同培養(yǎng)48h，離心收集細(xì)胞106，PBS洗兩次，用1×binding buffer 490μL重懸細(xì)胞，然后加入FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的Annexin V(FITC－Annexin V)和PI各5μL，置冰上作用10min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件做單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 As2O3和As2O3聯(lián)合維生素K3對(duì)RPMI8226細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 單用2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L維生素K3對(duì)RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且其作用呈時(shí)間和劑量依賴性;單用 2μmol/LAs2O3對(duì) RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，2μmol/LAs2O3聯(lián)合維生素K3對(duì)RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用與維生素K3劑量和作用時(shí)間有關(guān)，2μmol/LAs2O3聯(lián)合 2、5、10μmol/L 維生素 K3作用 48h、72h對(duì)RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)抑制顯著(P＜0.05)。

2.2 DNA含量分析 2μmol/LAs2O3作用于 RPMI8226細(xì)胞48h后，出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞增高，S期減少;2μmol/L As2O3聯(lián)合5μmol/L維生素 K3作用于RPMI8226細(xì)胞48h后，出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞增高，S期降低，且2μmol/L As2O3聯(lián)合5μmol/L維生素K3較單用2μmol/L As2O3后G0/G1期細(xì)胞增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 As2O3和As2O3聯(lián)合維生素K3對(duì)RPMI8226細(xì)胞的凋亡率影響 2μmol/LAs2O3和2μmol/LAs2O3聯(lián)合5μmol/L維生素K3作用于RPMI8226細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組顯著增高(P＜0.05)，且2μmol/L As2O3聯(lián)合 5μmol/L維生素 K3較單用2μmol/L As2O3細(xì)胞凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 示不同濃度的維生素K3和As2O3單獨(dú)及聯(lián)合作用48hRPMI8226細(xì)胞的凋亡率

不同劑量的As2O3、維生素K3單獨(dú)及聯(lián)合作用48h后細(xì)胞的凋亡率。分別為對(duì)照組，2μmol/L As2O3，2μmol/L As2O3+5μmol/L 維 生 素 K3組，2μmol/L As2O3+10μmol/L 維生素 K3組。

3 討論

As2O3是中藥砒霜的主要成分，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，砷的毒理、藥理研究也有了進(jìn)展，As2O3在體外可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［2－3］。本實(shí)驗(yàn)表明:As2O3與維生素K3聯(lián)合作用明顯提高了RPMl 8226細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性、S期細(xì)胞減少、使MM細(xì)胞阻滯于G1期，并抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這與砷劑能使淋系腫瘤發(fā)生G1期阻滯和使NB4細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯結(jié)果一致［4］。近年來(lái)國(guó)外不少學(xué)者報(bào)道，維生素K3對(duì)某些腫瘤細(xì)胞系的增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［5］。近年來(lái)國(guó)外不少學(xué)者報(bào)道，維生素K3對(duì)某些腫瘤細(xì)胞系的增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［6］。用As2O3與維生素K3聯(lián)合治療MM，可以減少As2O3的用量，降低砷劑對(duì)機(jī)體的毒性，起到增效減毒的作用，為臨床治療復(fù)發(fā)、難治MM提供了新思路。

［1］Grad J M，Balis N J，Krett N，et al.Arsenic trioxide uses caspasedependent and caspase － independent pathways in myeloma cells［J］.Mol Cancer Ther，2003，2(11):1155 －1164.

［2］YI Jing，YANG Jie，HE Rong，et al.Emodin enhances arsenicinducedapoptosis via generation of reactive oxygen species andinhibition of survival signaling［J］.Cancer Res，2004，64:108 －116.

［3］周宇紅，黃曉瑞，蔡循，等.三氧化二砷誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制研究［J］.中華腫瘤雜志，2001，23(3):181 －183.

［4］Rousselot P，Labaume S，Marolleau J P，et al.Arsenic t rioxide and melarsoprol induce apoptosis in plasma cell lines and in plasma cells f rom myeloma patient s.Cancer Res，1999，59:1041 －1048.

［5］徐波，王潔，卞度宏.三氧化二砷體外誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞株凋亡及其機(jī)制的研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(3):245 －247.

［6］Rajkumar S V，Leong T，Roche PC，etal.Prognostic value of bone marrow angiogenesis in multiple myeloma［J］.Clin Cancer Res，2000，6(8):3111－3116.