趙 暉，卓先義，向 平，嚴(yán) 慧，沈保華

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海200032）

GC-MS/MS法測定人頭發(fā)中的大麻酚類及其代謝物

趙 暉1，2，卓先義1，向 平1，嚴(yán) 慧1，沈保華1

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海200032）

目的 建立同時檢測頭發(fā)中 Δ9-四氫大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和 Δ9-四氫大麻酸（THCCOOH）的分析方法。方法 頭發(fā)樣品加入氘代內(nèi)標(biāo)Δ9-四氫大麻酸（THC-COOH-d3），經(jīng)堿水解后，以混合溶劑[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯=9∶1]進(jìn)行提取，吹干，殘留物經(jīng)雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用GC-MS/MS方法進(jìn)行分析。 結(jié)果 頭發(fā)中THC-COOH、THC、CBN和CBD的最低檢出限分別為4、4、10和20 pg·mg-1， 各化合物在0.04～5ng·mg-1呈良好的線性關(guān)系（r＞0.999），方法精密度、準(zhǔn)確度均符合要求。結(jié)論 本方法選擇性強(qiáng)、靈敏度高，適用于頭發(fā)中CBD、CBN、THC及其代謝物THC-COOH的分析，并成功應(yīng)用于實(shí)際案例中。

大麻酚；四氫大麻酸；頭發(fā)分析；GC-MS/MS

Abstract：ObjectiveTo develop a gas chromatography-tandem mass spectrometry （GC-MS/MS） method for the simultaneous analysis of Δ9-tetrahydrocannabinol （THC），cannabidol （CBD），cannabinol （CBN） and 11-nor-Δ9-carboxy-tetrahydrocannabinol （THC-COOH）in human hair.MethodsHair sample was spiked with deuterium labeled 11-nor-Δ9-carboxy-tetrahydrocannabinol （THC-COOH-d3） as internal standard，prior to being hydrolyzed with sodium hydroxide.The mixture was extracted with n-hexane/ethyl acetate （9： 1），derived with N，O-bis-（trimethylsilyl）-trifluoroacetamide （BSTFA），and analyzed with GC-MS/MS.ResultsThe limit of detection of THC-COOH，THC，CBN and CBD were 4，4，10，and 20pg/mg，respectively.Calibration curves covered a range from 0.04 to 5 ng/mg with good linearity （r＞0.999）.The accuracy and precision of analytes all met the requirements.ConclusionThe method has a good selectivity and high sensitivity，and is applicable to the analysis of CBD，CBN，THC and their metabolite THC-COOH.It has been verified in real cases.

Key words：cannabis;cannabinoid;THC-COOH;hair analysis;GC-MS/MS

大麻是一類化學(xué)成分復(fù)雜的精神活性藥物，Δ9-四氫大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（cannabidol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）是其主要成分。其中THC是大麻的主要活性成分，即使人體內(nèi)血藥濃度低于1ng·mL-1，也會產(chǎn)生持續(xù)作用[1]，令使用者產(chǎn)生欣快感、幻覺，引起血壓變化和心動過速。 Δ9-四氫大麻酸 （11-nor-Δ9-carboxy-tetrahydrocannabinol，THC-COOH）是THC的主要代謝物。

人體攝取大麻后，大麻酚類與大麻酸將沉積在毛發(fā)中，Skopp等[2]證明了毛發(fā)中大麻類成分沉積量與大麻攝入量的相關(guān)性，通過毛發(fā)分析可以定性/定量確認(rèn)檢查對象長周期內(nèi)的大麻使用情況。毛發(fā)分析協(xié)會（societyofhairtesting，SOHT）推薦毛發(fā)中THC及THCCOOH 檢測的cut-off值分別為0.05及0.005ng·mg-1[3]。在無法排除大麻酚類來自外部污染的情況下，陽性結(jié)果需要檢測THC-COOH進(jìn)行確認(rèn)[4]。大麻酚類（ng·mg-1級）和大麻酸（pg·mg-1級）成分在毛發(fā)中的含量極低[5-6]，并且毛發(fā)中內(nèi)源性雜質(zhì)較多，背景干擾嚴(yán)重，因此對毛發(fā)去污處理、分析儀器的靈敏度、特異性要求較高。向平等[7]報道了頭發(fā)中大麻酚類和Δ9-四氫大麻酸GC/MS分析方法，但對于THC-COOH檢出限（LOD）為0.01ng·mg-1，不能滿足 0.005ng·mg-1cut-off值的要求。本研究利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）、多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reactions monitor，MRM），同時檢測頭發(fā)中的大麻成分THC、CBD、CBN以及THC主要代謝物THC-COOH。本方法前處理簡單，分析速度快，能滿足實(shí)際工作的需要。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

THC、CBN、CBD對照品（國家麻醉品實(shí)驗(yàn)室）；Δ9-THC-COOH對照品（美國 Cerilliant公司）；內(nèi)標(biāo)Δ9-THC-COOH-d3對照品（美國 Sigma公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（美國 Sigma公司）；BSTFA（美國Cerilliant公司）；去離子水由 Milli-Q（美國Millipore公司）制備；其它試劑均為分析純?？瞻最^發(fā)來自健康志愿者；實(shí)際頭發(fā)樣品來自疑有大麻濫用史的嫌疑人頭發(fā)。

1.2 儲備溶液與工作溶液的制備

分別取 0.1mg·mL-1的 THC 對照品溶液、0.1mg·mL-1的CBD對照品溶液、0.1mg·mL-1的CBN對照品溶液和 0.1mg·mL-1的THC-COOH 對照品溶液各 100μL，用甲醇配制成10μg·mL-1的混合儲備溶液。依次用甲醇以 10 倍梯度稀釋儲備液，得到 1μg·mL-1、100ng·mL-1、10ng·mL-1的混合工作溶液。 另取 0.1mg·mL-1的THC-COOH-d3對照品溶液，用甲醇配制成1μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.3 儀器

Waters Quatto Micro氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配有電子轟擊源以及MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

HP-1MS石英毛細(xì)管柱 （30m×0.25mm×0.1μm）；分流比 2∶1；載氣：氦氣；程序升溫：100℃保持 1.5min，以升溫速率25℃/min升溫至280℃保持5min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜檢測采用MRM模式，以一級質(zhì)譜分析結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇各目標(biāo)物的分子離子，優(yōu)化碰撞能量（CE），得到各目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的二級質(zhì)譜圖。CBD、CBN、THC、THC-COOH和 THC-COOH-d3的 MS/MS條件見表1。

表1 大麻酚類及THC-COOH和內(nèi)標(biāo)的MS/MS條件

1.5 頭發(fā)樣品預(yù)處理

頭發(fā)樣品依次用0.1%十二烷基磺酸鈉 （SDS）溶液、0.1%洗潔精溶液、去離子水、丙酮振蕩洗滌。將頭發(fā)轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，濾去洗液后晾干，剪至成長約1～2mm。

稱取剪至約1～2mm的頭發(fā)50mg置試管中，加入0.5mL 1mol·L的NaOH溶液，加入 10μL內(nèi)標(biāo)工作液，在80℃水浴中水解20min。冷卻后，加入 20μL冰醋酸，調(diào)節(jié)體系pH至7～8，加入混合溶劑[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1]3mL，混旋，867×g 離心 3min，轉(zhuǎn)移有機(jī)相。向水相中加入20μL冰醋酸，調(diào)節(jié)體系pH至4～5，再用以上混合溶劑提取一遍。合并兩次提取液，置于60℃水浴中空氣流下吹干，殘留物中迅速加入20μL 乙腈和 20μL BSTFA，混旋，密封，置于烘箱中70℃衍生化20min。取1μL進(jìn)樣于GC-MS/MS。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS/MS分析條件的優(yōu)化

分別取 1μg·mL-1THC、CBN、CBD、THC-COOH和THC-COOH-d3對照品，BSTFA衍生化后，取1μL進(jìn)入GC-MS/MS。本方法中質(zhì)譜檢測采用MRM模式：（1）電離目標(biāo)化合物，產(chǎn)生碎片離子，選取特征離子，作為母離子；（2）調(diào)節(jié)碰撞能量（CE），裂解母離子，得到各化合物的二級質(zhì)譜離子；（3）選取響應(yīng)高的特征性二級碎片離子，作為子離子，組成母離子/子離子對，每目標(biāo)物選用兩對母離子/子離子對用于定性分析，其中一對母離子/子離子對用于定量分析。

2.2 方法專屬性

由于目標(biāo)化合物在毛發(fā)中的含量低，同時毛發(fā)中有較多的內(nèi)源性雜質(zhì)，背景干擾嚴(yán)重，這就要求檢測體系需同時具有高靈敏度和高特異性。本研究考察了對頭發(fā)中目標(biāo)化合物的專屬性：空白頭發(fā)樣品、添加內(nèi)標(biāo)的頭發(fā)樣品以及添加了10ng混合對照品的頭發(fā)樣品按1.5項(xiàng)下方法處理后，依次取1μL進(jìn)樣，GC-MS/MS進(jìn)行分析，結(jié)果表明，空白頭發(fā)的內(nèi)源性基質(zhì)在目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)對應(yīng)信號處無干擾（圖 1）。

圖 1 空白毛發(fā)添加內(nèi)標(biāo)（A）及添加了10ng混合對照品（B）的色譜圖

2.3 線性范圍和最低檢測限

空白頭發(fā)50mg若干份，分別加入內(nèi)標(biāo)物工作液，再加入不同濃度的目標(biāo)物 （THC、CBN、CBD、THCCOOH）混合工作溶液，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.004、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2 和 5ng·mg-1的系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣品，按1.5項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，按1.4項(xiàng)下GC-MS/MS條件進(jìn)樣分析。以目標(biāo)化合物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與目標(biāo)物相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行線性回歸，求得各目標(biāo)物的線性回歸方程（見表2）。結(jié)果表明各目標(biāo)物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。

THC-COOH的LOD可低至0.004ng·mg-1，定量下限（LOQ）為 0.04ng·mg-1，能滿足 SOHT 推薦的毛發(fā)中THC及THC-COOH檢測的cut-off值[3]0.05及0.005ng·mg-1的要求。

2.4 準(zhǔn)確度、精密度和回收率

空白頭發(fā)50mg若干份，同2.3項(xiàng)下方法配制得目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.04，0.4，5ng·mg-1的頭發(fā)樣品各6份，按以1.5項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，按1.4項(xiàng)下GC-MS/MS條件進(jìn)樣分析。通過計(jì)算每個樣品的實(shí)際測定值與配制值的百分比，考察方法的準(zhǔn)確度；通過計(jì)算每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)點(diǎn)樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的精密度。結(jié)果見表3，本方法的準(zhǔn)確度為82.0%～116.3%，方法的精密度RSD＜20%。

表3 毛發(fā)中THC、CBN、CBD、THC-COOH的準(zhǔn)確度和精密度

表2 毛發(fā)中THC、CBN、CBD、THC-COOH的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ

3 方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法，對兩名疑有大麻濫用史的嫌疑人的頭發(fā)進(jìn)行分析，兩名嫌疑人的尿液分析依據(jù)LC-MS/MS方法[8]進(jìn)行，用于判定嫌疑人近期大麻使用情況，通過定性分析，尿液中檢出CBN、THC和THC-COOH成分。按照本研究建立的方法，從兩名嫌疑人頭發(fā)中均檢出CBN和THC（定量結(jié)果見表4）。兩名對象頭發(fā)中THC濃度均高于SOHT推薦的THC cut-off值0.05ng/mg-1，由此可以推斷兩名嫌疑人存在濫用大麻行為。

表4 實(shí)際案例中大麻濫用嫌疑人的頭發(fā)分析結(jié)果

本研究建立的GC-MS/MS分析方法，頭發(fā)用量少，特異性強(qiáng)，靈敏度高，線性范圍寬，可同時分析人毛發(fā)中的CBD、CBN、THC和THC-COOH。本方法前處理簡單，分析速度快，能滿足吸食大麻鑒定實(shí)際工作的需要。

[1]Brunet B，Doucet C，Venisse N，et al.Validation of Large White Pig as an animal model for the study of cannabinoids metabolism：application to the study of THC distribution in tissues[J].Forensic Sci Int，2006，(161)：169-174.

[2]Skopp G，Strohbeck-Kuehner P，Mann K，et al.Deposition of cannabinoids in hair after long-term use of cannabis[J].Forensic Sci Int，2007，(170)：46–50.

[3]Society of Hair Testing.Recommendations for hair testing in forensic cases[J].Forensic Sci Int，2004，(145)：83-84.

[4]Nadulski T，Pragst F.Simple and sensitive determination of Δ9-tetrahydrocannabinol，cannabidiol and cannabinol in hair by combined silylation，headspace solid phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry[J].J Chromatogr B，2007，(846)：78-85.

[5]Huestis MA，Gustafson RA，Moolchan ET，et al.Cannabinoid concentrations in hair from documented cannabis users[J].Forensic Sci Int，2007，(169)：129-136.

[6]Uhla M，Sachsb H.Cannabinoids in hair： strategy to prove marijuana/hashish consumption[J].Forensic Sci Int，2004，(145)：143-147.

[7]向平，沈敏，沈保華，等.GC/MS同時分析頭發(fā)中大麻酚類和Δ9-四氫大麻酸[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（4）：216-219.

[8]卓先義，趙暉，向平.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時分析尿液中的大麻酚類和 Δ9-四氫大麻酸[J].中國司法鑒定，2008，(1)：21-25.

（本文編輯：劉 偉）

Analysis of Cannabinoids and The Main Metabolite in Human Hair by GC-MS/MS

ZHAO Hui1，2，ZHUO Xian-yi1，XIANG Ping1，YAN Hui1，SHEN Bao-hua1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China；2.Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China）

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2012.05.008

1671-2072-（2012）05-0071-04

2012-05-16

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（10-137）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（12DZ2271500）

趙暉（1984—）男，碩士研究生，主要從事毒物化學(xué)研究。 E-mail：bcldrhui@126.com。

沈保華（1968—）男，主任法醫(yī)師，主要從事毒物化學(xué)研究。 E-mail： shenbh@ssfjd.cn。