鄭艷麗，孫天敏，王 萌，李瑞花，姚柏春，譚華炳

阿爾茨海默?。ˋ1zheimer’s disease，AD）主要病理特征是大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球、基底前腦神經(jīng)元喪失、神經(jīng)突觸減少，細(xì)胞外存在大量由β－淀粉樣蛋白（β－amyloid，Aβ）組成的老年斑（senile plaques，SP）、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維絲纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制尚無定論。目前臨床治療AD的藥物只能緩解某些癥狀如改善AD患者學(xué)習(xí)記憶功能，既無有效方法緩解病情進(jìn)展，也無法補(bǔ)充大腦皮層、基底前腦和海馬大量丟失的神經(jīng)元、神經(jīng)突觸和神經(jīng)遞質(zhì)［1，2］。近幾年研究表明，絞股藍(lán)皂甙（stevenleafs，SLs）具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫以及顯著的抗氧化與神經(jīng)保護(hù)功能［3］，但SLs對(duì)AD治療作用的研究報(bào)道很少［4］。本實(shí)驗(yàn)首先原代培養(yǎng)胎鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元，應(yīng)用 MTT［3－（4，5－Dimethylthiazol－2－yl）－2，5－diphenyltetrazolium bromide］比色試驗(yàn)檢測(cè)SLs對(duì)細(xì)胞活性的影響。然后采用大鼠β淀粉樣蛋白1－40（rat amyloid beta peptide 1－40，Aβ1－40）誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元損傷，在體外建立 AD細(xì)胞模型。運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)和凋亡，觀察SLs對(duì)Aβ1－40誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元損傷的影響，為SLs用于臨床防治AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 孕15d～16dSD大鼠2只，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（鄂）2005－0008］提供。SLs購自上海億欣生物科技有限公司，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）購自美國 Promage公司。大鼠Aβ1－40、多聚賴氨酸、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司。Annexin V－FITC／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自武漢天源生物科技公司，兔抗人膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶抗體（rabbit anti－h(huán)uman choline acetyltransferase，ChAT Antibody）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase，iNOS）一抗、SABC試劑盒、胎牛血清、DMEM購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 基底前腦神經(jīng)元培養(yǎng) 孕15d～16dSD大鼠2只，無菌條件下，取胚鼠基底前腦原基，小心剝除軟腦膜，用眼科剪將其剪成小碎塊，并向其中加入0.25%胰蛋白酶，37℃水平搖床消化5min。用含血清的培養(yǎng)基（高糖EMEM＋2mmol／L谷氨酰胺＋0.1U／mL胰島素＋10%FBS）阻止消化，吹打混勻，1 000r／min離心10min；去上清，用含血清完全培養(yǎng)基（含B27，2%，V／V）重懸細(xì)胞，200目尼龍網(wǎng)過濾；細(xì)胞計(jì)數(shù)后，制成密度為1×106／mL細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的96孔板，每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞，在37℃含5%CO2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.5h、24h各換1次培養(yǎng)液，第3天添加阿糖胞苷（4mg／L），之后每隔3d換液1次。

1.2.2 建立AD細(xì)胞模型 將Aβ1－40溶于無菌生理鹽水（5 μg／mL），放入37℃溫箱孵育2周，使其變成絲狀聚集狀態(tài)。接種后第4天將細(xì)胞分為6組：空白對(duì)照組、BDNF組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組，每組設(shè)16個(gè)復(fù)孔。換液時(shí)，BDNF組、Aβ1－40＋BDNF組加入BDNF，終濃度為100μg／L；SLs組、Aβ1－40＋SLs組培養(yǎng)液中加入 SLs，終濃度400μg／mL［5］；Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組均加入Aβ1－40，終濃度為10μg／mL；空白對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液。1.2.3 MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活性 各干預(yù)因子作用48h后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行MTT比色試驗(yàn)。各組每孔加入20μL MTT（5g／L），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加200L DMSO溶液終止反應(yīng)，溫和振蕩10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解；然后在酶標(biāo)儀上波長為570nm檢測(cè)細(xì)胞積分吸光度（integral absorbance，IA），以IA值間接反映細(xì)胞存活數(shù)量及其功能狀態(tài)。

1.2.4 各組ChAT免疫陽性細(xì)胞數(shù)觀察 重新接種細(xì)胞于多聚賴氨酸包被的圓形蓋玻片，置入24孔板爬片，各干預(yù)因子作用48h后，結(jié)合SABC試劑盒說明，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色。常規(guī)清洗各組細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定10 min，封閉，分別加入一抗ChAT抗體，置4℃冰箱過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG（1∶75）室溫孵育30min，DAB顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀察。陰性對(duì)照用抗體稀釋液代替一抗作用，未見明顯的細(xì)胞著色。倒置顯微鏡下觀察并進(jìn)行ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)。

1.2.5 各組神經(jīng)元iNOS陽性表達(dá)的觀察 各干預(yù)因子作用48h后，采用SABC法進(jìn)行iNOS免疫細(xì)胞化學(xué)染色：分別加入一抗iNOS抗體，4℃搖床上孵育過夜；二抗為生物素化的羊抗兔Ig G（1∶100），室溫?fù)u床上孵育1.5h；ABC液室溫?fù)u床上孵育1.5h；DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。Olympus顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)視野中iNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)量。iNOS免疫細(xì)胞化學(xué)染色替代對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用0.1mol PBS取代iNOS抗體，結(jié)果為陰性。

1.2.6 各組神經(jīng)元凋亡檢測(cè) 各干預(yù)因子作用48h后，參照試劑盒說明進(jìn)行AnnexinV－FITC／PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的早期凋亡率。各組細(xì)胞培養(yǎng)于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用1.25 g／L胰酶＋0.2g／L EDTA消化并收集到10mL離心管中，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)／mL，取1mL細(xì)胞，1 000r／min離心5min，棄上清，加入1mL冷PBS重懸細(xì)胞，1 000r／min離心5min，棄上清，細(xì)胞重懸于250μL結(jié)合緩沖液，加入10μL Annexin V－FITC和5μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15min，加入250μL結(jié)合緩沖液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，數(shù)據(jù)由軟件收集和分析。相同方法重復(fù)檢測(cè)5次。1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 光鏡下陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)每張10個(gè)隨機(jī)視野中免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)后取平均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果，5張玻片計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值為最后結(jié)果。實(shí)驗(yàn)測(cè)定值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 SLs對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響 接種后24h培養(yǎng)的神經(jīng)元均已貼壁，多呈圓形，體積小，立體感強(qiáng)，彼此分散，細(xì)胞突起不明顯。培養(yǎng)3d后，神經(jīng)元生長良好，形態(tài)多樣，從多極到梭形，胞體飽滿，細(xì)胞間突起聯(lián)系廣泛。各干預(yù)因子作用48h后，空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目少，突起較細(xì)；BDNF組、SLs組細(xì)胞數(shù)目相對(duì)增多，胞體增大，突起明顯增粗、延長、分支多，相鄰細(xì)胞突觸相互連接成網(wǎng)；Aβ1－40組較空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目少，部分細(xì)胞皺縮，突起明顯變細(xì)、變短、分支少，相鄰細(xì)胞間突觸減少、相互連接稀疏；Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組神經(jīng)元生長狀況較Aβ1－40組明顯好轉(zhuǎn)，神經(jīng)元數(shù)量增多，胞體飽滿，突起增多、增粗、增長，相鄰神經(jīng)元間突觸較多、連接致密。

2.2 SLs對(duì)細(xì)胞活性的影響 空白對(duì)照組、BDNF組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組細(xì)胞積分吸光度（IA）分別為0.61±0.04、0.91±0.07、0.92±0.07、0.36±0.02、0.56±0.04、0.55±0.04。SLs組細(xì)胞活性較空白對(duì)照組高（P＜0.05），與BDNF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Aβ1－40＋SLs組細(xì)胞活性較 Aβ1－40組高（P＜0.05），與 Aβ1－40＋BDNF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 各處理組細(xì)胞IA值的比較

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察ChAT陽性細(xì)胞數(shù) 空白對(duì)照組、BDNF組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組ChAT陽性細(xì)胞數(shù)分別為43.00±2.73、64.00±4.57、61.00±4.62、21.00±1.92、41.00±2.69、40.00±2.54，SLs組與BDNF組ChAT陽性細(xì)胞數(shù)均高于空白對(duì)照組（P＜0.05），SLs組與BDNF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Aβ1－40＋SLs組和Aβ1－40＋BDNF組ChAT陽性細(xì)胞數(shù)均高于 Aβ1－40組（P＜0.05），Aβ1－40＋SLs組與 Aβ1－40＋BDNF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果見圖2。

圖2 各處理組ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)

2.4 SLs預(yù)處理對(duì)Aβ1－40誘導(dǎo)神經(jīng)元的iNOS表達(dá)的影響 空白對(duì)照 組、BDNF 組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF 組 和Aβ1－40＋SLs組iNOS免疫染色陽性細(xì)胞數(shù)分別為4 1.0 0±2.92、40.00±2.89、40.00±2.96、67.00±5.26、46.00±2.78、45.00±2.97。與空白對(duì)照組比較，Aβ1－40組iNOS免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P＜0.05）；與 Aβ1－40組比較，Aβ1－40＋SLs組和 Aβ1－40＋BDNF組iNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），說明SLs預(yù)處理可有效抑制 Aβ1－40誘導(dǎo)神經(jīng)元的iNOS表達(dá)的增加。詳見圖3。

圖3 SLs對(duì)Aβ1－40誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)的抑制作用

2.5 SLs預(yù)處理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 在流式細(xì)胞儀測(cè)定中，Annexin V／PI雙染色分出凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和正常細(xì)胞，空白對(duì)照 組、BDNF 組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF 組 和Aβ1－40＋SLs組細(xì)胞凋亡5次檢測(cè)結(jié)果相近，6組細(xì)胞凋亡數(shù)分別為30.00±2.31、29.00±2.12、28.00±2.49、57.00±3.83、33.00±1.75、34.00±3.46。與空白對(duì)照組比較，Aβ1－40組細(xì)胞凋亡數(shù)增高（P＜0.05）；與 Aβ1－40組比較，SLs＋Aβ1－40組和Aβ1－40＋BDNF組細(xì)胞凋亡數(shù)降低（P＜0.05），說明SLs預(yù)處理對(duì)Aβ1－40誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用。詳見圖4。

圖4 各組細(xì)胞凋亡率比較

3 討 論

基底前腦聚集著神經(jīng)系統(tǒng)約30%膽堿能神經(jīng)元，又是海馬膽堿能傳入纖維的起源。基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失與海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)膽堿能傳入神經(jīng)支配的損害是學(xué)習(xí)記憶減退原因之一。因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的損害是造成AD主要可能機(jī)制，從而提出了“膽堿能假說”［6］。Aβ是AD腦內(nèi)老年斑的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，Aβ的毒性作用是AD發(fā)病機(jī)制中的中心環(huán)節(jié)。Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠模型已廣泛應(yīng)用于AD實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)取胚鼠基底前腦原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，采用大鼠Aβ1－40誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元損傷，在體外建立AD細(xì)胞模型［7］；培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，可控性很強(qiáng)，有利于排除非處理因素對(duì)結(jié)果的影響。

BDNF是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)。BDNF分子單體是由119個(gè)氨基酸殘基組成的分泌型成熟多肽，蛋白等電點(diǎn)為9199，分子量為1 315kD，主要由β折疊和無規(guī)N－級(jí)結(jié)構(gòu)組成。分析表明BDNF的氨基酸序列有相當(dāng)一部分與神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）相同，故通稱為神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factor，NTF），常用于作為神經(jīng)元保護(hù)作用研究的陽性對(duì)照藥物。絞股藍(lán)皂甙來源于葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Mak.的全草。屬絞股藍(lán)總皂甙的共約有80余種，其中78種分別命名為絞股藍(lán)皂甙Ⅰ～LXXVⅢ，其中有一部分分別為人參皂甙Rb1、Rb3、Rd，以及人參二醇、2α－羥基人參二醇，2α，19－二羥基－12－脫氧人參二醇等。其成分的含量測(cè)定和成品標(biāo)準(zhǔn)，也都以人參皂甙Rb1的多少作為標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Aβ1－40＋SLs組細(xì)胞活性與ChAT陽性細(xì)胞數(shù)均高于 Aβ1－40組（P＜0.05），Aβ1－40＋SLs組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞凋亡數(shù)均低于Aβ1－40組（P＜0.05）。即SLs可促進(jìn)體外培養(yǎng)的膽堿能神經(jīng)元及其突起生長，可提高神經(jīng)元的活性和ChAT表達(dá)；并可有效抑制Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)元iNOS表達(dá)和細(xì)胞凋亡。我們認(rèn)為，SLs可能是通過對(duì)抗Aβ氧化損傷等途徑來發(fā)揮作用。一方面，SLs對(duì)抗Aβ引起的細(xì)胞膜損傷，保護(hù)細(xì)胞膜完整性，降低Ca2＋的通透性，減少Ca2＋內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的大量產(chǎn)生，從而抑制細(xì)胞損傷、凋亡或死亡［5］。另一方面，SLs對(duì)抗Aβ引起的線粒體膜穩(wěn)態(tài)及完整性的破壞，恢復(fù)線粒體電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶的活性，改善線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡［8］。SLs也可能是通過影響B(tài)ax／bcl－2、細(xì)胞色素C、caspase－3等細(xì)胞凋亡相關(guān)因子活性來抑制細(xì)胞凋亡［9］。

本實(shí)驗(yàn)研究證明絞股藍(lán)皂甙對(duì)Aβ誘導(dǎo)的胚鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷有明顯的拮抗作用，即絞股藍(lán)皂甙對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用；進(jìn)而為防治AD提供了一種新的活性物質(zhì)。但多數(shù)研究表明［10，11］，絞股藍(lán)皂甙防治AD的作用可能是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的結(jié)果，其詳細(xì)的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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