孔晶

摘要：利用基因敲除的方法將野生型谷氨酸棒狀桿菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）定向缺失ｄｔｓＲ１基因，構建△ｄｔｓＲ１突變菌株，分析其在無誘導條件、添加吐溫-４０及生物素限制條件下菌體的生長和谷氨酸生產(chǎn)情況，并與野生型谷氨酸棒狀桿菌在相同的發(fā)酵條件下進行比較。結果發(fā)現(xiàn)，在無誘導條件下，△ｄｔｓＲ１突變菌株能夠引發(fā)谷氨酸的合成，而野生型谷氨酸棒狀桿菌不分泌谷氨酸。在添加吐溫-４０及生物素限制條件下，△ｄｔｓＲ１突變菌株的谷氨酸產(chǎn)量明顯高于無誘導條件下的谷氨酸產(chǎn)量。ｄｔｓＲ１基因的缺失提高了菌株的生長與谷氨酸合成的能力，在無誘導條件下也能促使谷氨酸的合成。

關鍵詞：谷氨酸棒狀桿菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；ｄｔｓＲ１基因；谷氨酸發(fā)酵

中圖分類號：Ｑ９３６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）16－3584-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｔｓＲ１ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｌｕｔａｍａｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ＫＯＮＧ Ｊｉｎｇ

（Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｉｙｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｉａｎ ２２３００３，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｋｎｏｃｋｅｄ ｄｔｓＲ１ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ △ｄｔｓＲ１ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ， ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｅｅｎ－４０ ｏｒ ｂｉｏｔｉｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｄａｔａ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｌｕｔａｍａｔｅ synthetized ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ △ｄｔｓＲ１ ｍｕｔａｎｔ ｕｎｄｅｒ ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｈｏｗｅｖｅｒ， ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｄ ｎｏｔ ｓｅｃｒｅｔ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｔ ａｌｌ． Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ △ｄｔｓＲ１ ｍｕｔａｎｔ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｕｎｄｅｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｅｅｎ－４０ ｏｒ ｂｉｏｔｉｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｄｔｓＲ１ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｅｌｅｖａｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｅｖｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ； ｄｔｓＲ１ ｇｅｎｅ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

谷氨酸是１８６６年由德國的Ｒｉｔｔｈａｕｓｅｎ博士從小麥面筋中分離得到的一種酸性氨基酸［１］。它大量存在于谷類蛋白質(zhì)中，參與動物、植物和微生物中的許多重要化學反應。谷氨酸在醫(yī)藥、食品工業(yè)有著廣泛的應用，在醫(yī)學上其主要用于治療肝性昏迷，還可用于改善兒童智力發(fā)育；在食品工業(yè)上，谷氨酸－鈉鹽（味精）是常用的增鮮劑［２，３］。

現(xiàn)代化生產(chǎn)谷氨酸的方法主要是微生物發(fā)酵，在適當?shù)臈l件下，微生物可利用自身的新陳代謝積累合成Ｌ－谷氨酸。目前工業(yè)上應用的谷氨酸產(chǎn)生菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細菌。其中谷氨酸棒狀桿菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）是目前工業(yè)生產(chǎn)最常用的菌株之一［４，５］。

乙酰輔酶Ａ羧化酶（ＤｔｓＲ蛋白）是乙酰輔酶Ａ（乙酰ＣｏＡ）羧化酶復合體的組分之一。乙酰ＣｏＡ羧化酶復合體是參與脂肪酸合成的生物素結合酶，它由生物素結合亞基和羧基轉(zhuǎn)移酶亞基構成，其中ＤｔｓＲ蛋白和谷氨酸合成密切相關［６］。將ｄｔｓＲ１基因敲除后，發(fā)現(xiàn)谷氨酸合成增加，因此ＤｔｓＲ１蛋白可以影響谷氨酸合成途徑。本試驗利用基因敲除技術篩選獲得△ｄｔｓＲ１突變菌株，觀察ｄｔｓＲ１基因缺失對谷氨酸棒狀桿菌的谷氨酸產(chǎn)量的影響。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試驗菌株谷氨酸棒狀桿菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及已經(jīng)定向缺失ｄｔｓＲ１基因的△ｄｔｓＲ１突變菌株由淮陰工學院生命科學與化學工程學院生物工程實驗室構建并保存。

１．１．２培養(yǎng)基ＬＢ培養(yǎng)基的配制見《分子克隆實驗指南（第三版）》［７］?；A發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖３０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．４ ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，維生素Ｂ１ ２００ μｇ／Ｌ，生物素３００ μｇ／Ｌ，大豆蛋白水解物（總氮量為３５ ｇ／Ｌ），ＣａＣＯ３ ５０ ｇ／Ｌ，用ＫＯＨ調(diào)至ｐＨ ８．０。

１．２方法

１．２．１種子搖瓶培養(yǎng)將菌株從新鮮的ＬＢ平板上接種到含３０ ｍＬ ＬＢ－葡萄糖培養(yǎng)基（含１．２ ｍＬ ５００ ｇ／Ｌ葡萄糖母液）的５００ ｍＬ三角瓶中，于３０ ℃以１２０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)過夜。

１．２．２發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)將種子液添加到含２０ ｍＬ基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的５００ ｍＬ三角瓶中，于３０℃以１２０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)３６ ｈ進行谷氨酸發(fā)酵。

１．２．３ｄｔｓＲ１基因缺失對谷氨酸發(fā)酵的影響ｄｔｓＲ１基因缺失對無誘導條件下谷氨酸發(fā)酵的影響：將△ｄｔｓＲ１突變菌株與野生菌株用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，測定菌體生長情況與谷氨酸產(chǎn)量。ｄｔｓＲ１基因缺失對添加吐溫-４０條件下谷氨酸發(fā)酵的影響：將基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度調(diào)整為５０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度調(diào)整為３０ ｇ／Ｌ，加入吐溫-４０至終濃度５ ｇ／Ｌ，觀察在添加吐溫-４０條件下△ｄｔｓＲ１突變菌株生長與谷氨酸合成的情況。ｄｔｓＲ１基因缺失對生物素限制條件下谷氨酸發(fā)酵的影響：將基礎發(fā)酵培養(yǎng)基去除生物素，并將葡萄糖濃度調(diào)整為５０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度調(diào)整為３０ ｇ／Ｌ，分析生物素限制條件下△ｄｔｓＲ１突變菌株生長與谷氨酸合成的情況。

１．２．４分析方法菌體生長：取不同時間段的發(fā)酵液，用ＤＵ ６４０核酸蛋白分析儀檢測６００ ｎｍ處的吸光度（A６００ ｎｍ）。谷氨酸定量測定：取樣品液１００ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液１００ μＬ、衍生化試劑鄰苯二甲醛４００ μＬ，混勻靜置２ ｍｉｎ，使用Ｃ１８色譜柱（Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＣＬＣ－ＯＤＳ，２５０ ｍｍ×４ ｍｍ，５ μｍ），流動相Ａ為０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣ２Ｈ３Ｏ２（ｐＨ ５．８９），流動相Ｂ為甲醇，流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ，柱溫設定為４０ ℃，測定２１０ ｎｍ處的吸光度（A２１０ ｎｍ）。

２結果與分析

２．１ｄｔｓＲ１基因缺失對無誘導條件下谷氨酸發(fā)酵的影響結果

如圖１所示，在無誘導條件下△ｄｔｓＲ１突變菌株明顯有谷氨酸分泌，發(fā)酵３６ ｈ谷氨酸濃度為７９．１ ｍｍｏｌ／Ｌ，其生長速度低于野生型谷氨酸棒狀桿菌，培養(yǎng)約３０ ｈ到達穩(wěn)定期。野生型谷氨酸棒狀桿菌不能分泌谷氨酸，但可以利用培養(yǎng)基成分生長，培養(yǎng)１２～２４ ｈ達到對數(shù)生長期，２４ ｈ達到穩(wěn)定期。

２．２ｄｔｓＲ１基因缺失對添加吐溫-４０條件下谷氨酸發(fā)酵的影響結果

△ｄｔｓＲ１突變菌株發(fā)酵培養(yǎng)３６ ｈ后，在吐溫

-４０添加條件下谷氨酸濃度為９５．７ ｍｍｏｌ／Ｌ，吐溫

-４０添加使△ｄｔｓＲ１突變菌株谷氨酸產(chǎn)量增加２１％。A６００ ｎｍ結果顯示，添加吐溫-４０后，△ｄｔｓＲ１突變菌株生長速度略低于無誘導條件下菌體的生長速度（圖２）。

２．３ｄｔｓＲ１基因缺失對生物素限制條件下谷氨酸發(fā)酵的影響結果

在生物素限制條件下，△ｄｔｓＲ１突變菌株發(fā)酵培養(yǎng)３６ ｈ后谷氨酸濃度為９３．３ ｍｍｏｌ／Ｌ，比無誘導條件下該菌株的谷氨酸濃度高出１８％。在生物素限制條件下△ｄｔｓＲ１突變菌株的菌體生長速度高于添加吐溫-４０條件下，但低于無誘導條件下的突變菌株的生長速度（圖３）。

３小結與討論

ＤｔｓＲ１蛋白和谷氨酸合成密切相關，在添加青霉素或表面活性劑（如吐溫-４０）、生物素限量等谷氨酸合成誘導條件下，ＤｔｓＲ１蛋白的表達量明顯下降，因而推測ＤｔｓＲ１蛋白的減少與谷氨酸的過量合成密切相關。將ｄｔｓＲ１基因敲除后，發(fā)現(xiàn)α－酮戊二酸脫氫酶復合體（ＯＤＨＣ）活性下降了３０％，ＯＤＨＣ活性的下降使代謝流充分流向谷氨酸合成方向［８，９］，因此推論ＤｔｓＲ１蛋白是通過影響ＯＤＨＣ活性間接影響谷氨酸合成途徑的［１０］。

本研究觀察到在無誘導條件下，野生型谷氨酸棒狀桿菌無谷氨酸分泌，而△ｄｔｓＲ１突變菌株明顯有谷氨酸分泌，而且突變菌株的生長速率明顯下降，說明ｄｔｓＲ１基因的缺失抑制了菌體生長并誘發(fā)了谷氨酸的合成。△ｄｔｓＲ１突變菌株的谷氨酸產(chǎn)量在添加吐溫-４０和生物素限制條件下均高于無誘導條件，說明谷氨酸合成誘導條件能促使△ｄｔｓＲ１突變菌株分泌更多谷氨酸。

總之，ｄｔｓＲ１基因的缺失由于引起ＯＤＨＣ活性下降，從而使谷氨酸合成代謝途徑得到優(yōu)化，導致谷氨酸合成的增加，這與國外研究結果一致［１0］。為更好地了解谷氨酸合成的相關分子機制，需要對其合成途徑和回補途徑之間其他的刺激因子和抑制因子進行深入研究。

參考文獻：

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