韓燕峰 張延威 董旋 黃玉 梁宗琦

摘要：研究蛹蟲(chóng)草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）的發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果，為蛹蟲(chóng)草抑菌活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。采用濾紙柱、海綿柱和花泥柱３種方法檢測(cè)其抑菌效果，結(jié)果表明蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液及菌絲提取物對(duì)大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）均有一定抑制作用，其中菌絲提取物抑菌作用較強(qiáng)；對(duì)大腸桿菌的抑制強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制。抑菌效果檢測(cè)方法以濾紙柱法檢測(cè)效果較好，花泥柱法次之，海綿柱法較差。

關(guān)鍵詞：蛹蟲(chóng)草；抑菌；檢測(cè)方法；發(fā)酵液；菌絲提取物

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ５６７．３５；Ｑ９３９．９６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）16－3492-04

Studies on Antibacterial Activities of Fermentation Broth and Mycelia Extraction of Cordyceps militaris

ＨＡＮ Ｙａｎ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ－Ｗｅｉ２，ＤＯＮＧ Ｘｕａｎ１，ＨＵＡＮＧ Ｙｕ1，ＬＩＡＮＧ Ｚｏｎｇ－ｑｉ1

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｕｎｇｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，China；

２． Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００１８，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ａｎｄ ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． For ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ method ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ by ｆｌｏｗｅｒ ｍｕｄ ｃｏｌｕｍｎ， ｔｈｅ ｗｏｒｓｔ ｗａｓ ｓｐｏｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｂｏｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ stronger ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ； ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｏｔｈ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗａｓ stronger ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ； ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ； ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

蛹蟲(chóng)草又名北冬蟲(chóng)夏草，是我國(guó)名貴中藥材冬蟲(chóng)夏草的代用品，含有多種生物活性物質(zhì)［１，２］。蛹蟲(chóng)草為蟲(chóng)、菌結(jié)合體，其真菌也常被稱(chēng)為蛹蟲(chóng)草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲(chóng)草的子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中均有多種活性成分，能抑制部分細(xì)菌和真菌，對(duì)人體具有一定的保健功效，具有潛在應(yīng)用前景［３－５］。一些關(guān)于蛹蟲(chóng)草的研究認(rèn)為，蛹蟲(chóng)草的抗菌成分可能是蟲(chóng)草素［６，７］、多糖［８］、多肽［９］、酶類(lèi)［１０］或酚類(lèi)［１１］，具有抑菌作用可能是單一成分導(dǎo)致也有可能是多組分協(xié)同作用。劉陽(yáng)等［１２］報(bào)道發(fā)酵液的抑菌效果是單一活性成分抑菌效果的２倍，表明蛹蟲(chóng)草中多種活性成分共同作用的抑菌效果好于單一活性成分的抑菌效果。但針對(duì)某一種微生物而言，其主要抑菌活性物質(zhì)應(yīng)該是一類(lèi)或一種物質(zhì)。

試驗(yàn)采用３種檢測(cè)材料對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲提取物和發(fā)酵液進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)比較，和常用的抑菌效果檢測(cè)采用的濾紙片法和牛津杯法有所不同。同時(shí)比較不同發(fā)酵天數(shù)的蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果，以期為蛹蟲(chóng)草抑菌活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

１材料與方法

１．１供試菌株

蛹蟲(chóng)草ＧＺＵＩＦＲ－ＺＨ菌株、大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）為貴州大學(xué)真菌資源研究所微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

１．２培養(yǎng)基

ＰＤＡ固體培養(yǎng)基：馬鈴薯２００ ｇ去皮切塊，煮沸３０ ｍｉｎ后６層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖、瓊脂各２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯２００ ｇ去皮切塊，煮沸３０ ｍｉｎ后６層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，分裝至２５０ ｍＬ三角瓶中，每瓶裝液１００ ｍＬ。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａCｌ ５ ｇ，瓊脂２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

細(xì)菌培養(yǎng)液：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａCｌ ５ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

１．３試驗(yàn)方法

１．３．１母液培養(yǎng)與發(fā)酵蛹蟲(chóng)草菌種活化后，從ＰＤＡ斜面試管中挑取適當(dāng)大小的菌塊，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，１７０ ｒ／ｍｉｎ ２５ ℃搖床培養(yǎng)，待母液孢子數(shù)達(dá)到１０６個(gè)／ｍＬ時(shí)用移液槍吸取母液轉(zhuǎn)接至新的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量每瓶１ ｍＬ，１７０ ｒ／ｍｉｎ ２５ ℃搖床培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)周期為１０ ｄ。

１．３．２抑菌材料制作濾紙柱：?。磸埗ㄐ詾V紙為一疊，用打孔器打孔得到直徑為６ ｍｍ的濾紙片，壓平后分裝入潔凈的培養(yǎng)皿中，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干，使用時(shí)５疊濾紙片為一組（即一個(gè)濾紙柱由２０張濾紙片組成）。

海綿柱：取規(guī)整、質(zhì)地均勻的海綿塊（購(gòu)自超市），用打孔器打孔得到直徑為８ ｍｍ、高７ ｍｍ的海綿柱，分裝入潔凈的培養(yǎng)皿，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干。

花泥柱：取無(wú)損、質(zhì)地均勻的花泥塊（購(gòu)自花店），用打孔器打孔得到直徑為７ ｍｍ、高７ ｍｍ的花泥柱，分裝入潔凈的培養(yǎng)皿，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干。

１．３．３菌絲提取液制備準(zhǔn)確稱(chēng)?。埃保?ｇ烘干后的菌絲，放于１．５ ｍＬ蒸餾水中，于超聲波振蕩儀中提取３０ ｍｉｎ。

１．３．４細(xì)菌菌懸液制備供試菌種活化后，從斜面培養(yǎng)基刮下部分菌體，接種于細(xì)菌培養(yǎng)液中，３７ ℃培養(yǎng)１８ ｈ，培養(yǎng)后的菌液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以細(xì)菌培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)菌濃度至１０６個(gè)／ｍＬ，制成細(xì)菌菌懸液。

１．３．５瓊脂擴(kuò)散法（Ｋ－Ｂ法）試驗(yàn)

１）取已滅菌的干凈培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入約２０ ｍＬ的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，靜置待其凝透，取水平無(wú)冷凝水的平板使用。用移液槍移?。保担?μＬ細(xì)菌菌懸液添加到平板，涂布均勻，靜置３０ ｍｉｎ待菌液吸收。

２）用移液槍移取培養(yǎng)１～１０ ｄ的發(fā)酵液或菌絲提取液１００ μＬ分別加到已滅菌干燥的濾紙柱、海綿柱及花泥柱上，再將其移入平板中如圖１的相應(yīng)位置，每個(gè)平板每種材料設(shè)對(duì)照１個(gè)、供試液１個(gè)，共６個(gè)，３種材料間隔放置，各材料間距離相等。３個(gè)重復(fù)。發(fā)酵液的空白對(duì)照為蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基，菌絲提取物的空白對(duì)照為蒸餾水。

３）將上述平板移入冰箱中靜置，待液體充分浸漬到培養(yǎng)基后３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ，觀察記錄抑菌圈大小，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取其平均值。

２結(jié)果與分析

２．１蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液的抑菌效果

含發(fā)酵液的濾紙柱、海綿柱和花泥柱對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果見(jiàn)表１、圖２。由表１、圖２可見(jiàn)，海綿柱法未能檢測(cè)到抑菌效果，而采用濾紙柱和花泥柱的僅培養(yǎng)７ ｄ的發(fā)酵液出現(xiàn)抑菌效果，且對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。說(shuō)明在試驗(yàn)中培養(yǎng)７ ｄ的發(fā)酵液抑菌物質(zhì)含量最高，而其余時(shí)間可能是因?yàn)橐志镔|(zhì)含量低未能檢測(cè)到抑菌效果。

２．２蛹蟲(chóng)草菌絲提取物的抑菌效果

含菌絲提取物的濾紙柱、海綿柱和花泥柱對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果見(jiàn)表２、圖３。由表２、圖３可見(jiàn)，培養(yǎng)４ ｄ后的菌絲提取物在濾紙柱法和花泥柱法檢測(cè)中出現(xiàn)抑菌效果，且隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌絲提取物的抑菌作用增強(qiáng)。培養(yǎng)９ ｄ的菌絲提取物在海綿柱法檢測(cè)中表現(xiàn)出抑菌效果，抑菌圈較前兩種方法小。同時(shí)可看出菌絲提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。

在試驗(yàn)條件下３種材料用于抑菌檢測(cè)的效果為：濾紙柱效果最佳，花泥柱次之，海綿柱最差。

２．３菌絲提取物和發(fā)酵液抑菌效果比較

對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，只有培養(yǎng)７ ｄ的發(fā)酵液檢測(cè)出抑菌效果，而從培養(yǎng)４ ｄ開(kāi)始菌絲提取物表現(xiàn)出抑菌作用，且抑菌作用隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)。比較表１和表２數(shù)據(jù)，可見(jiàn)蛹蟲(chóng)草菌絲提取物的抑菌效果強(qiáng)于發(fā)酵液的抑菌效果。

３小結(jié)與討論

１）試驗(yàn)中為保證使用的３種材料測(cè)定的抑菌效果具有可比性，以濾紙柱所能吸收的最大加液量為限，設(shè)計(jì)加液量為１００ μＬ，但實(shí)際使用中海綿柱及花泥柱可吸收的最大加液量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于１００ μＬ，故可能存在花泥柱與海綿柱因加液量不足未能表現(xiàn)出應(yīng)有的檢測(cè)效果。在試驗(yàn)操作方面，累加５疊濾紙片需要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，容易導(dǎo)致細(xì)菌污染，移動(dòng)及擺放存在一定難度；海綿柱因無(wú)法主動(dòng)吸水，需要擠壓才能將液體吸入，操作麻煩，也存在較大被污染的可能性；花泥柱可主動(dòng)吸收液體，拿取容易，擺放方便，較前兩者更為方便。綜合考慮吸液量大小與操作簡(jiǎn)便性，推測(cè)使用花泥柱只要方法恰當(dāng)，就能達(dá)到較好的檢測(cè)效果，具體情況有待下一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

２）試驗(yàn)中的發(fā)酵液具有抑菌效果，這與武忠偉等［４］的報(bào)道一致。陳宏偉等［８］報(bào)道蟲(chóng)草多糖具有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)１１．３ ｍｍ，本試驗(yàn)采用超聲波法提取的菌絲提取物的抑菌活性也較強(qiáng)，培養(yǎng)１０ ｄ其對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到１２．５0 ｍｍ。由于試驗(yàn)采用的是粗提液，發(fā)酵液的抑菌成分和菌絲提取物的抑菌成分的確定還有待進(jìn)一步研究。

３）從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，濾紙柱在檢測(cè)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)物的抑菌效果中表現(xiàn)較好，花泥柱次之，海綿柱較差；蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液和菌絲提取物均有抑菌作用，總體上對(duì)大腸桿菌的抑制強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制；菌絲提取物的抑菌作用強(qiáng)于發(fā)酵液。

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