田華，于斐，汪金萍

（1.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南信陽464000；2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南鄭州450052；3.信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校生物技術(shù)系，河南信陽464000）

葡萄糖對螺旋藻生長的影響及機(jī)理分析

田華1，于斐2，汪金萍3

（1.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南信陽464000；2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南鄭州450052；3.信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校生物技術(shù)系，河南信陽464000）

研究葡萄糖對螺旋藻生長的影響，結(jié)果表明，葡萄糖濃度為3.0 g/L時(shí),干重最大，是對照的1.29倍，并發(fā)現(xiàn)采用不滅菌Zarrouk培養(yǎng)基混合營養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻是可行的。葡萄糖對螺旋藻生長的影響機(jī)理可能是外源葡萄糖對螺旋藻細(xì)胞的生理和代謝產(chǎn)生影響，使整個(gè)細(xì)胞處于比較活躍的生理狀態(tài)，導(dǎo)致螺旋藻光合反應(yīng)速率增加、光飽和值升高、暗呼吸和光補(bǔ)償點(diǎn)也顯著提高，藻生物量濃度較光合自養(yǎng)有很大程度提高。

鈍頂螺旋藻；混合營養(yǎng)培養(yǎng)；葡萄糖；pH

Abstract:Influence of glucose on the cell dry weight of Spirulina platensis was studied.The results showed that when glucose concentration was 3.0 g/L,the cell dry weight was up to the highest,which was 1.29 times to the same culture without glucose.At the same time,we found that mixotrophic culture of Spirulina platensis used the medium of Zarrouk without sterilizling was feasible.The mechanisms maybe was that glucose influences the physiological and metabolism of Spirulina platensis cells and makes the whole cells in comparative active physiological condition,so result in photosynthetic reaction rate increasing,spirulina saturated value,dark light breathing and compensation points increasing significantly,the biomass of Spirulina platensis improving greatly compared with phototrophic culture.

Key words：Spirulina platensis;mixotrophism;glucose;pH

螺旋藻是一種單細(xì)胞絲狀藍(lán)藻，蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%~70%，并含有人體自身不能合成的8種氨基酸，且氨基酸含量平衡，富含維生素、多不飽和脂肪酸、碳水化合物及微量元素等[1]。目前已應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域，因此螺旋藻是一項(xiàng)具有巨大開發(fā)潛力和利用價(jià)值的多功能產(chǎn)品。近年來發(fā)現(xiàn)螺旋藻可以利用葡萄糖等有機(jī)底物進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)，葡萄糖對螺旋藻生長影響的研究已有不少報(bào)道[1-6]，研究表明葡萄糖對螺旋藻生物量的積累具有促進(jìn)作用，但影響的機(jī)理還不明確。并且添加葡萄糖混合營養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)需提前對培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，操作復(fù)雜，生產(chǎn)成本提高。因此本文從簡化操作、節(jié)約生產(chǎn)成本的目的出發(fā)，對培養(yǎng)螺旋藻的Zarrouk培養(yǎng)基進(jìn)行不滅菌混合營養(yǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過對培養(yǎng)液進(jìn)行污染檢查，探討高密度混合營養(yǎng)培養(yǎng)的可行性，并分析葡萄糖促長的可能機(jī)理，期望為大規(guī)模工業(yè)化混合營養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻提供可靠的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)方法

供試藻種為鈍頂螺旋藻fachb-350 Spirulinaplatensis：引自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所；采用Zarrouk培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,未經(jīng)高溫滅菌。在混合營養(yǎng)培養(yǎng)過程中，添加一定量的葡萄糖，使其形成一濃度梯度：0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L。培養(yǎng)基的初始 pH為9.5，30℃恒溫光照搖床培養(yǎng)9 d，4 klx光照，搖瓶速度為120 r/min。每天定時(shí)測定培養(yǎng)液中pH。同時(shí)設(shè)立對照。

1.2 儀器設(shè)備

ZHWY-111B大容量恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；AR520型電子精密天平：奧豪斯儀器公司；0.45 μm微孔濾膜：上海市新亞凈化器件廠；pHS-3C數(shù)字式酸度計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；LX-101數(shù)字光度表：美國Lutron公司；ECLIPSE-E200顯微鏡：Nikon公司；DB-206SC電熱鼓風(fēng)干燥箱：成都天宇實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.3 細(xì)胞濃度的測定

細(xì)胞干重的測定見文獻(xiàn)[7]。

1.4 培養(yǎng)液污染檢查[8]

在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和可能的染菌情況，并采用平板涂布的方法進(jìn)行進(jìn)一步的檢查。具體操作如下：取1 mL的藻液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.0）上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，檢查是否形成菌落及形成個(gè)數(shù)。若每毫升藻液活菌數(shù)量達(dá)到1×10-3個(gè)菌落，此時(shí)雜菌濃度相當(dāng)于1 μg/L，則認(rèn)為藻液已被污染，重新進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖濃度對螺旋藻混合營養(yǎng)分批培養(yǎng)的影響

圖1描述了不同葡萄糖濃度對螺旋藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)分批培養(yǎng)干重的影響。

由圖1可以看出，與對照組相比，添加葡萄糖的藻體生長較快，培養(yǎng)9 d的生物量較光合自養(yǎng)均有不同程度的提高。其中葡萄糖濃度為3.0 g/L時(shí)，干重是對照的1.29倍，說明在螺旋藻培養(yǎng)過程中添加葡萄糖可以大大提高螺旋藻的生物量。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到4.0 g/L時(shí)，螺旋藻顏色變黃，生長受到抑制，用針頭濾器過濾時(shí)藻液中有黃色大分子難溶物，可能為藻體異常代謝物。其余的葡萄糖濃度分別為 0.0、1.0、2.0、3.0 g/L 的培養(yǎng)穩(wěn)定，顏色墨綠，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)藻體排列規(guī)律，呈正常的螺旋狀，沒有異形物。由此可見3.0 g/L的葡萄糖濃度是支持該藻株混合營養(yǎng)分批培養(yǎng)的最佳濃度。

2.2 混合營養(yǎng)分批培養(yǎng)過程中pH的變化

螺旋藻培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的pH是螺旋藻在一定環(huán)境下代謝產(chǎn)物的綜合指標(biāo)，是一項(xiàng)重要的培養(yǎng)參數(shù)，螺旋藻對pH適應(yīng)范圍，取決于螺旋藻的生態(tài)學(xué)，在培養(yǎng)過程中pH會(huì)隨著基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)條件及藻類繁殖代謝而不斷波動(dòng)，如果培養(yǎng)液的pH偏高或偏低，螺旋藻的生長繁殖和產(chǎn)物積累就要受到顯著影響。因此，在研究葡萄糖對螺旋藻生長的影響研究中有必要對螺旋藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)過程中的pH變化進(jìn)行詳細(xì)的研究，以分析葡萄糖對螺旋藻生長的促長機(jī)理。螺旋藻混合營養(yǎng)分批培養(yǎng)過程中的pH變化，見圖2。

圖2中斜率代表pH的變化率，從圖2中可以看出，不添加葡萄糖的培養(yǎng)液隨培養(yǎng)時(shí)間的延長變化較快，原因主要是不添加葡萄糖的培養(yǎng)液中，NaHCO3作為主要碳源，HCO3-→CO32-+OH-，放出大量的OH-，從而使pH升高；添加葡萄糖的培養(yǎng)液中，隨葡萄糖添加量的增加，pH變化緩慢，這說明螺旋藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)優(yōu)先利用葡萄糖，這與螺旋藻采用NaHCO3和葡萄糖作為混合碳源培養(yǎng)時(shí)優(yōu)先利用葡萄糖的報(bào)道一致[8]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在螺旋藻光合自養(yǎng)及混合營養(yǎng)培養(yǎng)的過程中，pH從初始9.5逐漸升高到10.42，如此高的pH抑制了雜菌的生長，從而使螺旋藻光合自養(yǎng)及混合營養(yǎng)培養(yǎng)基不滅菌培養(yǎng)可行。

2.3 培養(yǎng)液污染檢查

分別對上述培養(yǎng)液進(jìn)行污染檢查，發(fā)現(xiàn)均未污染，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)藻體排列規(guī)律，未發(fā)現(xiàn)異形物，肉眼觀察顏色墨綠，螺旋藻長勢良好，這也證明了采用不滅菌Zarrouk培養(yǎng)基添加葡萄糖混合營養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻是可行的。

2.4 影響機(jī)理分析

藍(lán)細(xì)菌是通過主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞綌z入外源有機(jī)底物，葡萄糖進(jìn)入藍(lán)細(xì)菌不是一個(gè)容易的過程。葡萄糖在進(jìn)入藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞后主要是通過磷酸戊糖途徑被藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞利用，直接參與構(gòu)成細(xì)胞成分，參與螺旋藻細(xì)胞的分裂。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后首先在葡萄糖激酶的作用下發(fā)生磷酸化反應(yīng)，繼而參與到各個(gè)代謝過程中去，葡萄糖激酶是細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶。螺旋藻混合營養(yǎng)生長時(shí)，被利用的葡萄糖既作為細(xì)胞生長的能源，又作為細(xì)胞生長的碳源，甚至葡萄糖本身或葡萄糖的某一種間接代謝產(chǎn)物還有可能成為細(xì)胞生理的調(diào)節(jié)和刺激物質(zhì)，因此外源葡萄糖的存在不可避免的對細(xì)胞的生理和代謝產(chǎn)生影響，使整個(gè)細(xì)胞處于比較活躍的生理狀態(tài)[9]。現(xiàn)在進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，混合營養(yǎng)條件下細(xì)胞葡萄糖激酶的活力明顯高于光合自養(yǎng)條件下的葡萄糖激酶的活性，有機(jī)碳源被微藻細(xì)胞攝入后，將參與到細(xì)胞的代謝，有機(jī)碳源的利用會(huì)影響細(xì)胞初級代謝的流動(dòng)狀況，與光合自養(yǎng)過程相比，混合營養(yǎng)生長過程中，磷酸戊糖途徑氧化性分支的反應(yīng)過程明顯加強(qiáng)，并隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，有機(jī)碳源被細(xì)胞用作碳源的比例可能減小，而用作能源的比例有所增加。藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞中由于缺少α—酮戊二酸脫氫酶和琥珀酰輔酶A合成酶，三羧酸循環(huán)被認(rèn)為是不完全的，葡萄糖的氧化釋放CO2彌補(bǔ)了氣體碳源CO2供應(yīng)的不足，并可能使細(xì)胞在碳源利用中所消耗的ATP和NADPH有所節(jié)省[10]，因此在混合營養(yǎng)培養(yǎng)的條件下，光合反應(yīng)速率增加、光飽和值升高、暗呼吸和光補(bǔ)償點(diǎn)也顯著提高，藻生物量濃度較光合自養(yǎng)有很大程度提高。

3 結(jié)論

研究了葡萄糖對螺旋藻生長的影響及機(jī)理分析，結(jié)果表明：3.0 g/L的葡萄糖濃度是支持該藻株混合營養(yǎng)分批培養(yǎng)的最佳濃度，并且采用不滅菌Zarrouk培養(yǎng)基混合營養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻是可行的。影響的可能機(jī)理是：外源葡萄糖的存在不可避免的對細(xì)胞的生理和代謝產(chǎn)生影響，使整個(gè)細(xì)胞處于比較活躍的生理狀態(tài)，影響細(xì)胞初級代謝的流動(dòng)狀況。與光合自養(yǎng)過程相比，混合營養(yǎng)生長過程中，磷酸戊糖途徑氧化性分支的反應(yīng)過程明顯加強(qiáng)，并隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，有機(jī)碳源被細(xì)胞用作碳源的比例可能減小，而用作能源的比例有所增加，葡萄糖的氧化釋放CO2彌補(bǔ)了氣體碳源CO2供應(yīng)的不足，并可能使細(xì)胞在碳源利用中所消耗的ATP和NADPH有所節(jié)省，最終導(dǎo)致螺旋藻光合反應(yīng)速率增加、光飽和值升高、暗呼吸和光補(bǔ)償點(diǎn)也顯著提高，藻生物量濃度較光合自養(yǎng)有很大程度提高。

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Influence of Glucose on the Culture of Spirulina platensis and Mechanism Analysis

TIAN Hua1,YU Fei2,WANG Jin-ping3
（1.College of Life Sciences,Xinyang Normal University,Xinyang 464000，Henan,China;2.College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,Henan,China;3.Department of Biotechnology,Xingyang Agricultural College,Xinyang 464000,Henan,China)

2011-12-14

河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（112102210309）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2011B180051）；信陽師范學(xué)院青年骨干教師資助計(jì)劃

田華（1979—），女（漢），講師，在讀博士，研究方向：生物技術(shù)。