王艷萍，欒天奇，郗宏波，李騫，王金菊

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

發(fā)酵酸菜中嗜熱鏈球菌的分離鑒定與特性研究

王艷萍，欒天奇，郗宏波，李騫，王金菊

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

從東北自然發(fā)酵酸菜中分離篩選得到一株乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、顯色培養(yǎng)基初步鑒定和API鑒定為嗜熱鏈球菌，命名為ST-111，對(duì)其進(jìn)行生理特性及耐酸、耐鹽試驗(yàn)的初步研究，該嗜熱鏈球菌在pH 4以下幾乎不生長，最適生長pH為7~10，最適鹽濃度為0%~3%；在MRS液體培養(yǎng)基中菌株生長較快，2 h即達(dá)到對(duì)數(shù)期，12 h達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)OD600可以達(dá)到4.5左右；該菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，培養(yǎng)24 h后發(fā)酵液pH可降到3.6以下；耐膽鹽試驗(yàn)和膽固醇移除率試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株具有較強(qiáng)的膽鹽耐受力和較高的膽固醇移除率，在0.1%膽鹽條件下生長良好，在0.1%的膽鹽條件下的膽固醇移除率為42.3%。

嗜熱鏈球菌；鑒定；膽固醇移除率

Abstract:One strain of Streptococcus was separated and screened from natural fermentation sauerkraut,and identified as Streptococcus thermophilus by morphological identification,color-display medium preliminary appraisal and API test,named ST-111.The growth and fermentation characteristics of this strain were studied in detail.The result indicate that this strain's optimum growth pH value is 7-10,optimum growth salt concentration was 0%-3%.The strain grows well and performs high acid-producing ability in liquid MRS,and achieve the log phase in 2 hours and stable phase in 12 hours while the OD600can reach 4.5 or so;the broth pH can drop below 3.6 after cultured for 24 h.Bile tolerance test and cholesterol removal test indicate that the strain has high bile salt tolerance and cholesterol-removing ability.The strain grows well in the MRS broth containing 0.1%bile salt and the cholesterol-removing rate can reach to 42.3%.

Key words：Streptococcus thermophilus;identification;cholesterol-reducing ability

自然發(fā)酵的酸菜中存在大量的乳酸菌，是良好的乳酸菌菌種來源[1]。近年來，乳酸菌由于具有特殊的生理活性和營養(yǎng)功能，日益引起人們的重視。酸菜作為一種傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品，也越來越受到人們的青睞[2]。深入研究且開發(fā)利用東北酸菜資源，對(duì)擴(kuò)大益生菌資源及發(fā)現(xiàn)新菌種有著積極的意義。

嗜熱鏈球菌是“公認(rèn)安全性（GRAS）”的，廣泛用于生產(chǎn)一些重要的發(fā)酵乳制品，包括酸奶和奶酪（如瑞士干酪、林堡干酪）[3]。研究表明嗜熱鏈球菌可以產(chǎn)生一些具有功能活性的物質(zhì)，比如胞外多糖、細(xì)菌素和維生素等；此外，嗜熱鏈球菌還具有降低膽固醇的功能[4]。血漿中膽固醇水平過高，是引起動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因子。現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與膽石癥與高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性。國內(nèi)外大量研究表明，膽固醇代謝的紊亂直接與腸內(nèi)菌群脫抱合作用的減少和對(duì)膽固醇還原能力的下降有關(guān)，如乳酸菌的存在與血漿膽固醇的減少有直接關(guān)系[5]。本研究從酸菜中分離得到一株具有良好的產(chǎn)酸特性的乳酸菌，對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定及對(duì)生物學(xué)特性研究膽固醇降解率的研究，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

試驗(yàn)材料：天津市售東北自然發(fā)酵酸菜；培養(yǎng)基、生化試劑及染色劑：API試劑盒；MRS培養(yǎng)基、LM 17養(yǎng)基；各種生化試劑和染色液均按文獻(xiàn)所介紹的方法配制[6]。

1.1.2 儀器

Eppendorf 5415 D離心機(jī)；金鐘DY-2型厭氧培養(yǎng)箱；瑞利UV-9100紫外可見分光光度計(jì)；METTLER TOLEDO 320 pH計(jì)；Nikon YS-100光學(xué)顯微鏡；SANYO超低溫冰箱；Yamato SM 510滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離篩選

稱取20 g酸菜研磨磨碎，倒入180 mL生理鹽水中，然后進(jìn)行梯度稀釋，涂布平板后于37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，對(duì)獲得的一株革蘭氏陽性鏈球菌菌株劃線分離純化2次~3次后進(jìn)行接觸酶反應(yīng)為陰性，基本確定為乳酸菌[7]，于甘油管中在-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 分離菌株的生理生化鑒定

將純化菌株接種到LM 17培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)24 h進(jìn)行培養(yǎng)。生理生化鑒定按照法國梅里埃（BioMerieux）公司的產(chǎn)品使用手冊(cè)，采用API 50 CH試劑盒和API CHL培養(yǎng)基進(jìn)行49種碳水化合物的發(fā)酵試驗(yàn)。菌株依照梅里埃公司的菌種鑒定數(shù)據(jù)庫鑒定。

1.2.3 分離菌株的生理特性研究

1.2.3.1 生長曲線的測(cè)定及pH變化

取培養(yǎng)12 h的菌液以2%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣，用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光值，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，測(cè)定生長曲線。同時(shí)每2 h用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液pH。

1.2.3.2 菌株對(duì)不同初始pH、鹽濃度及膽鹽濃度的適應(yīng)性

取對(duì)數(shù)生長期的菌液以2%的接種量接入初始pH分別為2~10的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，于600 nm測(cè)定OD值。

取對(duì)數(shù)生長期的菌液以2%的接種量接入添加0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、18%NaCl的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)基24 h，空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，600 nm測(cè)定OD值。

取對(duì)數(shù)生長期的菌液以2%的接種量接入添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)牛膽鹽的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%溴甲酚紫作為指示劑，觀察其顏色的變化。

1.2.3.3 體外膽固醇移除率試驗(yàn)

在MRS液體培養(yǎng)基中添加0.1%的膽汁，同時(shí)加入按照Razin[8]等提供的方法制備的膽固醇膠束作為膽固醇膠束，即得MRSO-Chol培養(yǎng)基，最終膽固醇含量在0.1 mg/mL~0.3 mg/mL之間。螺口離心試管中加入10 mL上述培養(yǎng)液，按1%的量接入試驗(yàn)菌株，37℃培養(yǎng) 24 h；4℃，12000 r/min離心 10 min，按照 Rrudel和Morris[9]的膽固醇測(cè)定方法測(cè)定上清液膽固醇含量。以未接種的培養(yǎng)液作為對(duì)照，兩者之間的差值就是對(duì)應(yīng)菌株降解膽固醇的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理生化鑒定結(jié)果

菌株ST-111的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)，見圖1。

由圖1可知，在含有M17的培養(yǎng)基中，菌落呈球形凸起，邊緣整齊，直徑為0.3 mm~2 mm；顯微照片顯示菌株為革蘭氏陽性鏈球菌，因此可初步判斷該菌為乳酸鏈球菌。

圖2為24 h和48 h的API CHL碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)梅里埃公司的菌種鑒定數(shù)據(jù)庫查詢，進(jìn)一步確定菌株是唾液鏈球菌嗜熱亞種，即嗜熱鏈球菌，將其命名為ST-111。

2.2 生理特性研究

2.2.1 菌株的24 h生長曲線及pH變化曲線的測(cè)定

圖3為菌液OD值及pH隨培養(yǎng)時(shí)間變化的曲線圖。

由圖3可知，菌株生長較快，培養(yǎng)2 h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；同時(shí)該菌株產(chǎn)酸速度較快，對(duì)數(shù)生長期間發(fā)酵液中pH下降速度較快，穩(wěn)定期間pH下降不明顯，產(chǎn)酸速度與生長曲線呈正相關(guān)，培養(yǎng)24 h后pH可達(dá)3.6以下。

2.2.2 菌株對(duì)不同初始pH、鹽濃度的耐受性

菌株ST-111的生長pH范圍，見圖4。

如圖4所示，菌株在pH 2~4的培養(yǎng)基中幾乎不生長。pH 5~7時(shí)，培養(yǎng)24 h后，菌濃隨pH升高而增加；pH 7~10時(shí)，菌濃基本上保持不變，這說明，菌株生長pH范圍較大，在pH 7附近長勢(shì)良好，菌株的最適pH為6~10。不同鹽濃度下菌株生長情況，見圖5。

如圖5所示，菌株具有良好的耐鹽性，在鹽濃度為6%時(shí)仍有一定的生長能力，當(dāng)鹽濃度超過6%時(shí)幾乎不生長，該菌株的最適鹽濃度為0%~3%，由于發(fā)酵酸菜鹽濃度為2%~4%，因此該菌株適合作為發(fā)酵酸菜的發(fā)酵劑進(jìn)行開發(fā)。

2.2.3 菌株耐膽鹽能力的測(cè)定

?；悄懰徕c為人體膽汁中膽酸鹽的主要成分之一，因此選取該鹽對(duì)菌株的膽酸鹽耐受性進(jìn)行研究，人體小腸中膽汁鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%~0.3%之間波動(dòng)，耐膽鹽能力是益生菌的一項(xiàng)重要指標(biāo)[10]。菌株ST-111的耐膽鹽能力，見表1。

表1 菌株ST-111的耐膽鹽能力Table 1 Bile tolerance of ST-111

由表1可知，菌株所能生長的最高膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，表明該菌株具有良好的耐膽鹽能力。

2.2.4 體外降膽固醇試驗(yàn)

2.2.4.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

以膽固醇濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鄰苯二甲醛法測(cè)膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。

2.2.4.2 菌株膽固醇移除率的測(cè)定

對(duì)照組濃度為0.26 mg/mL，降解后接種ST-111菌株的上清液膽固醇濃度為0.15 mg/mL，降解率達(dá)到42.3%，試驗(yàn)結(jié)果表明菌株ST-111呈現(xiàn)一定的降膽固醇能力。

3 討論

本研究從東北酸菜中分離得到一株產(chǎn)酸性狀良好的乳酸菌，經(jīng)初步觸媒反應(yīng)及API鑒定為嗜熱鏈球菌，對(duì)其生理特性及體外膽固醇移除率進(jìn)行了初步研究。在37℃下，菌株生長速度較快，12 h后即進(jìn)入穩(wěn)定期，并且該菌株產(chǎn)酸速度較快，培養(yǎng)24 h后pH可達(dá)3.6以下，此外，該菌株適應(yīng)初始pH以及鹽濃度的范圍較寬，最適生長pH為7~10，最適鹽濃度為0%~3%，具有良好的耐酸、耐鹽性，具有開發(fā)為酸菜發(fā)酵劑的潛力。胃腸道生存能力試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株能適應(yīng)較高濃度的膽鹽環(huán)境（正常人體小腸中濃度為0.03%~0.3%），具有較強(qiáng)的生存能力；降膽固醇試驗(yàn)表明，在含有0.1%膽固醇的MRS培養(yǎng)基中，該菌株的膽固醇移除率為42.3%，具有較高的膽固醇移除率。但是，由于人體小腸環(huán)境與體外培養(yǎng)基有很大不同，還需要應(yīng)用到體內(nèi)動(dòng)物模型中去驗(yàn)證，以進(jìn)一步論證所篩選菌株的降膽固醇性能。文中所篩選的菌株來自于天然發(fā)酵酸菜，具有很高的安全性，同時(shí)表現(xiàn)了較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽活性，因此，該菌株具有一定的應(yīng)用潛力及市場(chǎng)開發(fā)前景。

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Study on Isolation,Identification and Characteristics of a Streptococcus thermophilus from Fermentation Sauerkraut

WANG Yan-ping,LUAN Tian-qi,XI Hong-bo,LI Qian,WANG Jin-ju
（College of Food Engineering&Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China）

2011-12-12

“十二五”科技部高科技發(fā)展研究計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA 100904）

王艷萍(1962—)，女（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。