王曉文，岳喜慶，張俊偉，姜忠良

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110036）

酸敗的馬鹿初乳分離乳酸菌耐性研究

王曉文1，2，岳喜慶1，張俊偉2，姜忠良2

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110036）

從酸敗的馬鹿初乳中分離得到49株菌株，經(jīng)革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)及生理生化試驗(yàn)共計(jì)鑒定出12種乳酸菌，這些乳酸菌以中溫型乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌。為鑒定馬鹿初乳中乳酸菌對(duì)機(jī)體的適應(yīng)能力，對(duì)這12種乳酸菌進(jìn)行耐性試驗(yàn)，主要驗(yàn)證其對(duì)人工胃液、人工腸液的耐受性，結(jié)果表明其中的4株乳酸菌耐酸性較強(qiáng)，以13號(hào)菌耐酸性最強(qiáng)，這將為未來(lái)開(kāi)發(fā)鹿乳酸奶提供可靠地理論依據(jù)。

馬鹿初乳；酸??；乳酸菌；體外耐受試驗(yàn)

Abstract:49 bacterial strain was obtained from the lactic acid bacteria of rancid colostrum from Cervus elaphus and 12 of them was identified as lactobacillus by means of gram staining and enzyme contact test and the type of which is intermediate temperature.The tolerance experiment of the 12 strains of lactic acid bacteria was carried out to identify the adaptive capacity to the organism including the tolerance to the simulatedgastricfluid and the simulatedintestinalfluid.The resistance of 4 lactic acid bacteria of them to acid are stronger than the others and the No.13 is the strongest based on the results.These results will offer a reliable theoretical basis for the development of the Cervus elaphus yoghourt.

Key words：colostrum from Cervus elaphus;rancidity;lactic acid bacteria;tolerance experiment in vitro

馬鹿（Cervus elaphus），是屬于哺乳綱（Mammalia）偶蹄目（Artiodactyla）反芻亞目（Ruminantia）鹿科（Cervoidea）鹿亞科（Cervinae）鹿屬（Cervus）的動(dòng)物[1]，它的別名為赤鹿、紅鹿、八叉鹿，是我國(guó)的國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，同時(shí)還是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和其具有極重要的生態(tài)價(jià)值。馬鹿的初乳為黃色、淡黃色或黃白色，異常地濃稠，黏性也很大，略帶有堿味和微臭味[2]。這是因?yàn)閯?dòng)物的初乳（指產(chǎn)后1 d~3 d的乳）內(nèi)含有豐富的球蛋白、清蛋白、免疫體、白細(xì)胞、酶、維生素和溶菌素等[3]。

益生菌，是指定植于人體腸道內(nèi)，能夠產(chǎn)生確切的健康功效的活的有益微生物總稱。作為益生菌的雙歧菌和乳酸菌，具有抗腫瘤、抑制有害微生物的生長(zhǎng)、可以改善機(jī)體腸道內(nèi)菌群的分布、調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇和乳糖的代謝，同時(shí)還可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣的吸收和維生素的合成等。益生菌必須具有一定耐受機(jī)體的特性，如能夠耐受機(jī)體胃酸、耐受膽鹽、在機(jī)體腸道中定植及對(duì)宿主的安全性等[4-7]。自從益生菌的益生作用被證實(shí)以來(lái)，具有益生性能的新的菌株就不斷地被篩選和鑒定出來(lái)，同時(shí)也建立了許多在體外篩選益生菌方法[5，8-9]。本文從酸敗的馬鹿初乳中分離得到的乳酸菌進(jìn)行耐性研究，以探討其潛在的益生性。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來(lái)源：遼寧省清原縣養(yǎng)鹿場(chǎng)，為第2天的馬鹿初乳。將采集后的馬鹿初乳置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，使其酸敗。

培養(yǎng)基及試劑：MRS培養(yǎng)基，人工胃液，人工腸液[10]。

1.2 方法

1.2.1 溫度耐受試驗(yàn)

參照周德慶[11]的乳酸菌鑒定方法，在 10、15、40、45、50、60℃30 min 6個(gè)溫度梯度下，按2%的量接種供試菌液于5 mL經(jīng)過(guò)濾、滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，每株菌在每一溫度條件下設(shè)2個(gè)重復(fù)，并在各溫度下設(shè)兩管空白對(duì)照，于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d或冰箱內(nèi)培養(yǎng)2 d～5 d。目測(cè)菌懸液的渾濁度，記錄結(jié)果。

60℃30 min是指分離菌株接種后先在60℃恒溫培養(yǎng)30 min，然后在37℃下恒溫培養(yǎng)2 d。

1.2.2 pH耐受試驗(yàn)及耐酸性菌株的初步篩選

參照周德慶[11]的方法，用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH，制成不同pH梯度的MRS液體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基過(guò)濾），pH的參數(shù)（25℃測(cè)定）為 3.5、4.3、4.5、6.5、8.5、9.6，按 2%的接種量接種于供試菌液，每一菌株在同一pH條件下設(shè)兩個(gè)重復(fù)，并在各pH梯度下設(shè)兩管空白對(duì)照，置于37℃恒溫培養(yǎng)48 h，以空白MRS液體培養(yǎng)基做對(duì)照，在600 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光值。

1.2.3 耐受pH為3.0人工胃液乳酸菌菌株的篩選

取MRS乳酸菌的菌懸液0.5 mL與4.5 mL、pH為3.0的人工胃液混合后，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在開(kāi)始（0 h）和3 h后取樣品，測(cè)定其活菌數(shù)。

1.2.4 乳酸菌對(duì)人工消化液的耐受性測(cè)定

將篩選出的乳酸菌的MRS培養(yǎng)液經(jīng)離心（3000 r/min，10 min）后收集其菌體，再用無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2次，使其菌體懸浮于5 mL無(wú)菌生理鹽水中制成菌懸液。然后，將乳酸菌的菌懸液各0.5 mL分別接種于含4.5 mL過(guò)濾除菌處理的pH為2.0、3.0和4.0的人工胃液中，并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在開(kāi)始（0 h）和培養(yǎng)1、2、3 h分別取樣，測(cè)定其樣品的活菌數(shù)。然后取在不同pH的人工胃液中已經(jīng)消化了3 h的培養(yǎng)液0.5 mL，分別接種于4.5 mL過(guò)濾除菌的pH為8.0的人工腸液中，繼續(xù)置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別在0、3、6、24 h 測(cè)定其樣品的活菌數(shù)[12]。

1.2.5 發(fā)酵乳中的乳酸菌對(duì)人工消化液的耐受性測(cè)定

將供試乳酸菌，按2%（體積分?jǐn)?shù)）的量接種于質(zhì)量濃度為10 g/100 mL無(wú)菌脫脂乳中,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后而制成發(fā)酵乳,分別吸取0.5 mL接種于pH 為 1.2、2.0、3.0、4.0和 5.0的 4.5 mL過(guò)濾除菌的人工胃液中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在開(kāi)始和培養(yǎng)1、2、3 h取樣，測(cè)定其樣品的活菌數(shù)。繼而取0.5 mL已在人工胃液處理3 h的樣品，接種于4.5 mL過(guò)濾除菌的pH為8.0的人工腸液中，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在 0、3、6、24 h 測(cè)定其樣品的活菌數(shù)[12]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)分別3次獨(dú)立試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)以X±sd形式表示，采用最小顯著性方差分析，P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度耐受試驗(yàn)

將分離得到的12個(gè)菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在不同的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況，其結(jié)果如表1。

表1 溫度耐受性試驗(yàn)Table 1 Temperature tolerance experiment

表1表明，在低溫的環(huán)境下，大部乳酸菌均不能生長(zhǎng)，10℃培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有菌種可以生長(zhǎng)，可見(jiàn)低溫會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，15℃培養(yǎng)時(shí)也只有13號(hào)和14號(hào)菌有一定的生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)效果也不是很明顯。40℃和45℃這2個(gè)溫度下培養(yǎng)時(shí)大部分的乳酸菌都能生長(zhǎng)，而且都能呈現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)趨勢(shì)，所以這兩個(gè)溫度是乳酸菌生長(zhǎng)的最適生長(zhǎng)溫度。而50℃培養(yǎng)時(shí)有些乳酸菌雖也能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)的效果不明顯，由此可以判斷分離出來(lái)的乳酸菌以中溫型乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌（最適生長(zhǎng)溫度40℃）。

2.2 pH耐受試驗(yàn)

將分離得到的乳酸菌分別接種于不同pH的MRS液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后測(cè)定其菌懸液的吸光值，判斷其生長(zhǎng)的最佳環(huán)境。測(cè)定生長(zhǎng)后將吸光值繪制如圖1曲線。

圖1表明，這12株乳酸菌對(duì)不同pH的耐受能力有所不同。菌株在pH為3.5、4.3、4.5時(shí)，生長(zhǎng)情況較差或者說(shuō)幾乎不生長(zhǎng)，而在中性（pH 6.5）或在偏堿性（pH 8.5）的條件下均可以生長(zhǎng)，但在堿性條件下時(shí)生長(zhǎng)效果并不是很好。所有菌種在pH為6.5時(shí)生長(zhǎng)效果最佳，由此可以判斷乳酸菌的最適pH為6.5。

2.3 耐受pH為3.0人工胃液乳酸菌菌株的篩選

從自酸敗的馬鹿初乳中分離的12株乳酸菌，經(jīng)過(guò)在pH為3.5的MRS液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)和其在pH為3.0人工胃液中的存活率如表2所示。

表2 酸敗的馬鹿初乳分離乳酸菌在pH為3.5及pH為3.0人工胃液中的生長(zhǎng)情況Table 2 The growth of lactic acid bacteria separated from the rancid colostrum of Cervus elaphus in artificial gastric(pH=3.5 and pH=3.0)

表2說(shuō)明，在分離出的12種乳酸菌中，其中13、14、21、22、25、29、35、47 號(hào)菌株有一定的耐酸性，而在pH為3.0人工胃液中的存活率達(dá)50%只有4種，為13、29、35、47 號(hào)菌株。

2.4 乳酸菌對(duì)人工消化液的耐受性試驗(yàn)

將以上得到的4株菌株經(jīng)過(guò)pH為2.0，3.0和4.0的人工胃液消化3 h后，再分別接入pH為8.0的人工腸液，消化0、3、6、24 h后活菌數(shù)的變化如表3所示。

表3 耐酸性乳酸菌在人工胃液和腸液中消化后的存活數(shù)Table 3 The survive number of lactic acid bacteria which resistant to acid in the artificial gastric juice and intestinal juice for digestion

表3結(jié)果表明，這4株乳酸菌具有較強(qiáng)抗人工胃液消化能力，在pH為3.0和pH為4.0的人工胃液中持續(xù)消化3 h后其活菌數(shù)量不僅沒(méi)受影響，而且數(shù)量略有增加，其中13號(hào)菌株表現(xiàn)尤其明顯。這4株菌株經(jīng)過(guò)不同pH人工胃液消化后再進(jìn)入人工腸液消化24 h后，仍能保持較高數(shù)量的活菌，這一結(jié)果說(shuō)明它們均對(duì)人工腸道消化液具有很好的耐受性。

2.5 發(fā)酵乳中的乳酸菌對(duì)人工消化液的耐受性測(cè)定

將13號(hào)菌接種于10%的無(wú)菌脫脂乳中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，制成的發(fā)酵乳按1∶9比例與不同pH的人工胃液混合在37℃恒溫箱中消化3 h并進(jìn)入人工腸液消化24 h后活菌數(shù)的變化見(jiàn)表4。

表4 13號(hào)菌制作的發(fā)酵乳在人工胃液和腸液中消化后的存活數(shù)Table 4 The survive number of fermented milk made by the bacterium of No.13 in the artificial gastric juice and intestinal juice for digestion

表4結(jié)果表明，發(fā)酵乳中的13號(hào)菌在pH為1.2的人工胃液中消化3 h后活菌數(shù)幾乎已經(jīng)檢測(cè)不到；而在pH為2.0，3.0，4.0和5.0的人工胃液中消化3 h后，其存活數(shù)量幾乎未受影響。進(jìn)入pH為8.0的人工腸液消化3 h和6 h后，活菌數(shù)變化不大，消化24 h后活菌數(shù)略有降低。發(fā)酵乳中的乳酸菌對(duì)人工胃腸液的耐受性顯著要高于單純菌液，這是由于乳中的成分對(duì)人工消化液起緩沖作用及對(duì)菌體保護(hù)作用所致。

3 結(jié)論

1）從遼寧省清原縣養(yǎng)鹿場(chǎng)得到的馬鹿初乳酸敗后分離出的12株乳酸菌中其優(yōu)勢(shì)乳酸菌為40℃生長(zhǎng)良好的中溫型乳酸菌。

2）分離得到的13號(hào)乳酸菌為乳桿菌，從其耐酸性上來(lái)看馬鹿初乳中乳桿菌的耐酸性要比乳球菌的耐酸性要強(qiáng)。

3）在pH為3.0人工胃液消化3 h后，存活率最高的菌株為13號(hào)株為乳桿菌其存活率為99%。各菌株在不同pH的人工消化液中其生存率的高低呈菌株依賴性和pH依賴性。13號(hào)菌株對(duì)人工腸液也有很好的耐受性。將13號(hào)菌株制成發(fā)酵乳后，其對(duì)人工胃消化腸液的耐受性要明顯高于單純菌體，這是由于乳中蛋白質(zhì)對(duì)消化液起緩沖作用和對(duì)菌體起保護(hù)作用所致。

[1]侯扶江,常生華,于應(yīng)文.我國(guó)鹿況簡(jiǎn)介[J].草業(yè)科學(xué),2003(11):47-50

[2]周小鸞.母鹿初乳的抽取與哺喂[J].特種養(yǎng)殖,新農(nóng)村,2003(3):16

[3]趙世瑧.如何抽取母鹿初乳[J].特種養(yǎng)殖,中國(guó)農(nóng)業(yè)科技,2000(4):26

[4]Fuller R.Probiotics[M]//The scientific basis.New York:Chapman and Hall,1992:398

[5]Marteau P,Minekus M,Havenaar R,et al.Survival of Lacticacid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine:validationandtheeffectsofbile[J].JDairySci,1997,80:1031-1037[6]DE SMET I,VAN HOORDE L,Vande woestyne M,et al.Signifi cance of bile salt hydrolyticactivities of Lactobacilli[J].Journal of applied bacteriology,1995,79:292-301

[7]Lankaputhra W E V,Shah N P.Survival of Lactobacillus acidophilusand Bifidobacterium spp in the presence of acid and bile salts[J].Cult Dairy Prod J,1995,30:2-7

[8]Pettersson L,Graf W,Alm L,et al.Survival of Lactobacillusacidophilus NCDO 1748 in the human gastrointestinal tract.1.Incubation with gastric juice in vitro[J].Symposia of the Swedish Nutrition Foundation,1983(15):123-127

[9]Kimoto H,Omurai M,Obayashi M,et al.Identification andprobiotic characteristics of Lactococcus strains from plant materials[J].Japan agricultural research quarterly,2004,38(2):111-117

[10]張和平,孟和畢力格,王俊國(guó),等.分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中L.casei Zhang潛在益生特性的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),2006,34(4):4-10

[11]周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:56-59

[12]光岡知足.発酵微生物研究部特輯[M].ョーグルト用乳酸菌の効用,1994:3-1

The Study of the Tolerance of Lactic Acid Bacteria Separated from Rancid Colostrum of Cervus Elaphus

WANG Xiao-wen1,2,YUE Xi-qing1,ZHANG Jun-wei2,JIANG Zhong-liang2
(1.College of Food Science,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110866,Liaoning,China;2.College of Light Industry,Liaoning University,Shenyang 110036,Liaoning,China）

2011-12-13

王曉文（1970—），女（漢），在讀碩土研究生，講師，研究方向：動(dòng)物性食品研究。