馮衛(wèi)華，于立梅，秦艷，李冰霞，白衛(wèi)東

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225）

荔枝果肉多酚的提取與分離

馮衛(wèi)華，于立梅，秦艷，李冰霞，白衛(wèi)東

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225）

以荔枝果肉為試驗材料，以多酚含量為評定參數(shù)，提取分離其中的多酚物質。以乙醇溶液為提取溶劑，通過單因素試驗和正交試驗，考察了濃度、提取時間、料液比、提取溫度、浸提次數(shù)等影響提取率的幾個重要因素，得出影響果肉中多酚提取的因素由大到小依次為，提取時間>料液比>乙醇濃度>提取溫度，最佳工藝條件為，乙醇濃度70%，料液比1∶11，浸提時間6 h，浸提溫度40℃，浸提2次，而且荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚體為主，其次是低聚體和單體。

荔枝；多酚；提取；優(yōu)化；分離

Abstract:The optimum extraction conditions of phenolics from Litchi pulp were attained at a solvent-to-solid ratio of 11∶1 by agitated maceration with 70%ethanol at room temperature in the dark for 6 h from freezen sample.The residue was extracted repeatedly.The combined extracts were defatted by hexane,and then extracted by diethyl ether-ethyl acetate(1/1)to obtained Litchi phenolic extracts.And Litchi pulp polyphenols were mainly water-soluble polyphenol content,secondly oligomer and monomers content.

Key words：litchi;phenolic compounds;extraction;optimization;separation

荔枝（Litchi Chinensis Sonn.）營養(yǎng)價值高，風味獨特，被譽為“嶺南佳果”[1-2]。并且，荔枝中還含有荔枝多酚等多種活性成分，對降血壓、降血脂、抗腫瘤、防止動脈粥樣硬化、增強免疫力均有一定功效[3-7]。

荔枝采后極易褐變腐爛，荔枝深加工生產(chǎn)迫在眉睫。由于，新鮮荔枝釀酒提高了荔枝的商品價值，是荔枝產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要方向[8]。然而荔枝酒產(chǎn)品在裝瓶后或貨架期時存在氧化褐變、風味劣變等問題，這不僅影響了產(chǎn)品的外觀和風味，而且荔枝酒的營養(yǎng)成分也隨之發(fā)生變化，經(jīng)濟價值下降。

據(jù)報道，荔枝與荔枝殼褐變其主要原因是多酚物質氧化褐變的結果[9-10]。荔枝多酚在荔枝果皮葉、果肉、果核種皮中都有分布，荔枝葉及果皮多酚提取已有系統(tǒng)研究[11-12]，如何有效提取荔枝果肉中的多酚，進一步研究荔枝果肉多酚的特性及其在荔枝酒加工中的變化，為控制荔枝酒加工過程中褐變，進一步改進荔枝酒加工工藝，防止營養(yǎng)物質損失提供理論參考。

由于提取條件決定了提取物質的提取質量和提取率，因而提取工藝很重要[13-14]。傳統(tǒng)的溶劑提取法因成本低、對活性物質選擇性強、易控制等優(yōu)點在工業(yè)中普遍流行[13，15]。本研究選用溶劑提取法提取荔枝果肉中的多酚，以總酚含量作為評價指標，優(yōu)化荔枝果肉多酚的提取條件。

為了有效分離荔枝多酚，對經(jīng)優(yōu)化浸提的荔枝果肉提取液選用正己烷、乙酸乙酯∶無水乙醚（1∶1）分步萃取分離。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料預處理

荔枝：廣州市從化順昌源綠色食品有限公司。

新鮮的荔枝用不銹鋼刀迅速去除果皮、果核，將果肉裝入塑料袋中，立即冷凍（-18℃），保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗試劑

沒食子酸、福林試劑：Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO；其它試劑均為分析純。

1.1.3 試驗設備

W-754紫外可見分光光度計：北京瑞利分析有限公司；R205旋轉蒸發(fā)儀：無錫市星海王生化設備有限公司。

1.2 總酚（TPC）的測定

總酚（TPC）的測定采用福林-肖卡法[16]。

1.2.1 標準曲線繪制

準確稱取0.5 g沒食子酸溶于蒸餾水中，然后定容至100 mL，再取此原液0.5 mL稀釋至50 mL，即為標準溶液。準確量取 0.05、0.1、0.15、0.25、0.5 mL 于 10 mL容量瓶中，各加3 mL蒸餾水，搖勻，再加0.25 mL福林試劑，充分混勻。1 min后，加入20%Na2CO3溶液0.75 mL混勻，用蒸餾水定容?；旌弦河?5℃恒溫下水浴10 min后，立即冰浴，于760 nm波長下1 cm比色杯比色，由測得的吸光度繪制標準曲線?？瞻子谜麴s水代替沒食子酸標準溶液。

1.2.2 測定

取0.25 mL適當濃度的樣品液（用提取溶劑稀釋）于10 mL容量瓶中，空白用提取溶劑代替樣品，其余操作同上。根據(jù)測得的吸光度從標準曲線計算得荔枝多酚的含量。荔枝總酚的含量表示為每克新鮮樣品中含有的總酚量（以沒食子酸計，μg GAE/g FW）。

1.3 單因素試驗

1.3.1 浸提溶劑濃度的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，選用濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液作為浸提溶劑，料液比為1∶7，在60℃水浴鍋避光浸提6 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.2 料液比的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，采用80%的乙醇溶液作為提取溶劑，料液比為 1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13，在 60 ℃水浴鍋避光浸提6 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.3 浸提時間的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，采用80%乙醇溶液作為浸提溶劑，料液比為1∶9，在60℃水浴鍋避光浸提2、4、6、8、10 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.4 浸提溫度的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，采用80%的乙醇溶液作為提取溶劑，料液比為 1∶9，在 25、40、50、60、70 ℃水浴鍋分別避光浸提6 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.5 浸提條件優(yōu)化

在上面單因素試驗的基礎上，以乙醇為浸提劑，考察乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度四因素對荔枝果肉多酚提取效果的影響，擬定四因素三水平，采用L9（34）表進行正交試驗，分析荔枝果肉多酚在不同浸提條件下的提取率，確定最佳提取條件。

1.3.6 浸提級數(shù)的確定

以冷凍荔枝果肉為材料，采用優(yōu)化的浸提條件連續(xù)重復提取3次，立即測定每次浸提液中的總酚含量。

1.3.7 荔枝多酚的分離

將荔枝果肉（5.0 g左右）用優(yōu)化的浸提條件連續(xù)重復提取2次，過濾，合并兩次浸提液。將浸提液旋轉蒸發(fā)除去乙醇（40℃）至體積約為50 mL左右，將濃縮液經(jīng)等體積正己烷萃取去脂8次，再用等體積乙酸乙酯∶無水乙醚（1∶1）萃取荔枝多酚6次，將合并的乙酸乙酯/無水乙醚相旋轉蒸發(fā)（30℃）至干燥。將合并的水相放在干燥箱中40℃～50℃干燥，將正己烷相、乙酸乙酯/無水乙醚相、水相等干燥物分別定容，測定其多酚的含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個提取試驗均重復3次，每個測定均重復3次。結果表示為平均值±標準偏差。應用SPSS 11.5軟件（SPSS Inc,Chicago,IL,USA）對所有數(shù)據(jù)進行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析，p<0.05表示顯著，p<0.01表示極顯著。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對荔枝果肉多酚提取的影響

圖1為乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%時，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。結果表明，采用80%乙醇濃度浸提，提取液中總酚含量最高，多酚含量顯著高于其他浸提液提取的總酚含量（p<0.05）。因此初步確定乙醇濃度為80%比較合適。

2.2 料液比對荔枝果肉多酚提取的影響

圖 2 為料液比分別為 1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13 時，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。結果分析表明，料液比對荔枝果肉提取液中總酚含量的影響顯著（p<0.05）。采用1∶13浸提，提取液中總酚含量最高，并且隨著料液比的增大，荔枝果肉多酚浸提量顯著增加p<0.05）。根據(jù)Rubilar等[17]的研究，濃度梯度是提取的動力，因而提高料液比對提取有正面影響。然而，提高料液比雖然有利于總酚的提取，但當料液比達到某一極限時，再提高料液比收效不大（后一級料液比較前一級料液比增加的提取率分別為46.9%、36.7%、28.0%、18.1%）。由結果分析并考慮到濃縮時間，可將料液比確定為 1∶9。

2.3 提取時間對荔枝果肉多酚提取的影響

圖 3 為浸提時間分別為 2、4、6、8、10 h 時，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。

結果分析表明，浸提時間對荔枝果肉提取液中總酚含量的影響顯著（p<0.05）。采用6 h浸提，提取液中總酚含量最高。顯然，多酚的充分提取需要足夠的浸提時間，但是由于提取過程中多酚長時間處于高溫下，造成部分氧化，因而延長提取時間提取率反而下降[18]，因此，浸提時間不能太長。因此初步確定浸提時間6 h。

2.4 提取溫度對荔枝果肉多酚提取的影響

圖 4為提取溫度分別為 25、40、50、60、70℃時，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。結果表明，采用40℃浸提，提取液中總酚含量最高，其總酚含量顯著高于提取溫度分別為 25、50、60、70℃的總酚含量（p<0.05）。顯然，適宜的溫度有利于多酚的提取。綜合考慮，本試驗選擇溫度為40℃。

2.5 各因素綜合變化對荔枝果肉多酚提取的影響

以上結果均為單因素變化對荔枝果肉多酚提取的影響。為了全面考察乙醇濃度、料液比、浸提時間、浸提溫度4個因素對荔枝果肉多酚提取效果的影響，設計了四因素三水平正交試驗。因素水平的選擇是由單因素結果并綜合考慮時間效應而定。因素水平見表1，正交表及正交結果見表2，根據(jù)表2正交試驗結果，得表3方差分析結果。

通過表2正交試驗分析結果表明，影響荔枝果肉多酚類物質浸提量的因素主次順序為：B>C>A>D，即浸提時間對荔枝果肉提取液中總酚含量的影響最大，其次為料液比，乙醇濃度又次之，浸提溫度影響最小。荔枝果肉多酚的最佳提取條件為A1B2C3D1，即：70%乙醇按1∶11的料液比在溫度40℃下浸提6 h，荔枝果肉多酚浸提效果最好。表3方差分析結果表明，浸提時間對荔枝果肉多酚提取的影響達到極顯著水平（p<0.01）；乙醇濃度和料液比二因素對荔枝果肉多酚提取的影響達到顯著水平（p<0.05）。又通過對每個因素的三水平進行多重比較，結果如下：A因素（乙醇濃度）3個水平最優(yōu)是A1；B因素（提取時間）3個水平最優(yōu)是B2；C因素（料液比）3個水平最優(yōu)是C3，D因素（料液比）3個水平最優(yōu)是D1。即通過方差分析結果確定最佳組合依舊為A1B2C3D1。

表1 荔枝果肉多酚浸提條件的因素水平表Table 1 Factors and levels for the optimization of phenolics extraction conditions from Litchi-pulp

表2 荔枝果肉浸提L9（34）正交試驗方案及測定結果Table 2 Results of phenolics extraction from Litchi-pulp by L9(34)orthogonal design

表3 荔枝果肉浸提L9（34）正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of phenolics extraction results from Litchi-pulp by L9(34)orthogonal experiment

2.6 浸提級數(shù)對荔枝果肉多酚提取的影響

荔枝果肉用優(yōu)化的浸提條件連續(xù)重復提取3次，測定每次浸提液的總酚含量，見圖5。結果分析表明，提取級數(shù)對荔枝果肉提取液中總酚含量的影響顯著（P<0.05）。然而，第一、二、三次浸提總酚的量占總的總酚浸提量[（1.655±0.009）μg GAE/g FW]的比例分別為60.54%、21.67%、17.79%，第一、二次浸提的總酚量占總浸提量的83.21%?？紤]到提取的成本和后續(xù)操作的繁瑣與得率的關系，因此，本研究確定浸提次數(shù)為2次。

2.7 荔枝多酚的分離

采用優(yōu)化提取條件浸提的荔枝多酚浸提液用正己烷、乙酸乙酯/無水乙醚（1:1）分步萃取，得到荔枝多酚浸提液的正己烷相、乙酸乙酯/無水乙醚相和水相，分別測定此三相中總酚的含量（圖6）。結果分析表明，三相中多酚含量差異顯著（p<0.05），其中，水相的總酚含量最高，乙酸乙脂/無水乙醚相的總酚含量次之，正己烷相最小，根據(jù)Calliste等[19]的研究，水相中含有的酚類物質多為多酚的多聚體，而正己烷相及乙酸乙酯/無水乙醚相則為多酚的低聚體和單體。因此，荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚體為主，其次是低聚體和單體。

3 結論

本研究選用溶劑提取法提取荔枝果肉中的多酚，以總酚含量作為評價指標，優(yōu)化了荔枝果肉多酚的提取條件。影響荔枝果肉多酚提取的主要因素是浸提時間，其次為料液比，乙醇濃度又次之，浸提溫度影響最小，荔枝果肉多酚浸提的最佳工藝條件即為：采用70%乙醇，按1∶11的料液比在溫度40℃下浸提6 h，在此條件下浸提2次。荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚體為主，其次是低聚體和單體。

本研究為進一步研究了荔枝多酚的成分與組成、荔枝多酚的生物活性，進一步研究荔枝果肉多酚的特性及其在荔枝酒加工中的變化，為控制荔枝酒加工過程中褐變，進一步改進荔枝酒加工工藝，防止營養(yǎng)物質損失提供理論性指導。

[1]溫靖,肖更生,陳衛(wèi)東,等.荔枝的成分及加工利用研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2008(7):105-107

[2]岳強,曾新安,于淑娟,等.新鮮荔枝汁營養(yǎng)成分分析[J].食品工業(yè)科技,2006(4):173-174

[3]唐小俊,池建偉,張名位,等.荔枝多糖的提取條件及含量的測定[J].華南師范大學學報:自然科學版,2005(2):27-31

[4]胡位榮,張昭其,季作梁,等.荔枝冷害過程中果皮色澤、花色素苷和類黃酮含量的變化[J].園藝學報,2004,31(6):723-726

[5]董周永,池建偉,楊公明,等.荔枝的保健作用及開發(fā)利用前景[J].食品研究與開發(fā),2005,26(5):148-151

[6]吳華慧,李雪華,邱莉.荔枝、龍眼果肉及荔枝、龍眼多糖清除活性氧自由基的研究[J].食品科學,2004,25(3):166-169

[7]張永明,袁紅,田菊霞,等.荔枝核皂甙提取物對小鼠糖異生作用和血脂代謝的影響[J].杭州師范學院學報,2005,4(6):435-436

[8]曾憲遠,曾新安,彭超英,等.幾種添加劑對荔枝酒風味的影響[J].釀酒科技,2006(11):27-29

[9]Jiang Y M,Duan X W,Joyce D,et al.Advances in understanding of enzymatic browning in harvested litchi fruit[J].Food chemistry,2004,88:443-446

[10]Zhang Z Q,Pang X Q,Ji Z L,et al.Role of anthocyanin degradation in litchi pericarp browning[J].Food chemistry,2001,75:217-221

[11]吳國宏,熊何健.荔枝葉中多酚類物質的提取制備[J].食品科學,2007,28(6):131-135

[12]熊何健,鄭建華,吳國宏,等.荔枝多酚的分離制備及清除DPPH活性[J].食品科學,2006,27(7):86-88

[13]Hinneburg I,Neubert R H H.Influence of extraction parameters on the phytochemical characteristics of extracts from buckwheat(Fagopyrum esculentum)Herb[J].J Agric Food Chem,2005,53:3-7

[14]Kapasakalidis P G,Rastall R A,Gordon M H.Extraction of polyphenols from processed black currant (Ribes nigrum L.)Residues[J].J Agric Food Chem,2006,54:4016-4021

[15]韓丙軍,彭黎旭.植物多酚提取技術及其開發(fā)應用現(xiàn)狀[J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學學報,2005,11(1):21-26

[16]Singleton V L,Rossi J A.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents[J].Am J Enol Vitic,1965,16(3):144-158

[17]Rubilar M,Pinelo M,Ihl M,et al.Murta leaves(Ugni molinae Turcz)as a source of antioxidant polyphenols[J].J Agric Food Chem,2006,54:59-64

[18]莫燕霞,胡寶祥,莫衛(wèi)民.不同提取方法測定新鮮茶葉中茶多酚含量的比較研究[J].浙江工業(yè)大學學報,2008,36(2):158-161

[19]Calliste C A,Trouillas P,Allais D P,et al.Castanea sativa Mill.Leaves as new sources of natural antioxidant:an electronic spin resonance study[J].J Agric Food Chem,2005,53(2):282-288

The Optimum Extraction of Phenolic Compounds in Litchi Pulp

FENG Wei-hua,YU Li-mei,QIN Yan,LI Bing-xia,BAI Wei-dong
（College of Light Industry and Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,Guangdong,China）

2011-11-24

國家科技部星火計劃項目（2007EA781003）；廣東省科技計劃項目（2007B023001002）；廣州市科技計劃項目（2007ZE0091）；廣州市科技計劃項目（2009C6-I051）；仲愷農(nóng)業(yè)工程學院博士啟動基金項目（G2360280）

馮衛(wèi)華（1968—），女（漢），副教授，博士，研究方向：果蔬貯藏與加工、生物活性成分提取純化及功能分析。