徐旭耀，蕭許鳳，梅丹丹，余炳生

（湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東高校新材料工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東湛江524048）

紫外分光光度法測(cè)定柑橘皮中的總黃酮

徐旭耀，蕭許鳳，梅丹丹，余炳生*

（湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東高校新材料工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東湛江524048）

以蘆丁為對(duì)照品，271 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，采用紫外分光光度法測(cè)定柑橘皮中總黃酮的含量。蘆丁對(duì)照品在6.2 μg/mL~56 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.9993）。利用均勻設(shè)計(jì)法，以功率、時(shí)間、乙醇濃度、料液比等為考察因素，研究并比較超聲波和微波提取柑橘皮中總黃酮的條件，發(fā)現(xiàn)在所用的實(shí)驗(yàn)條件下微波法的總提取率高于超聲波法。微波法的較優(yōu)提取條件為：功率60%，時(shí)間7 min，乙醇濃度50%，料液比1∶45（g/mL）。因此，試驗(yàn)選用微波法作為柑橘皮中總黃酮的提取方法。方法的平均加標(biāo)回收率為99.5%，并用于柑橘皮中總黃酮的測(cè)定，取得了較滿意的結(jié)果。

超聲波；微波；柑橘皮；總黃酮；紫外分光光度法；均勻設(shè)計(jì)法

Abstract:Total flavonoid in citrus peels was determined by UV spectrophotometry at 271 nm using rutin as the standard compound.The calibration curve was linear in the range of 6.2 μg/mL-56 μg/mL for rutin(r=0.9993).The extraction conditions of total flavonoid from citrus peels were compared by ultrasonic and microwaveassistance with the uniform design method,with respects of power,extracting time,ethanol concentration,ratio of solid to liquid as the investigated factors,and it was found that the microwave extraction rate was higher than ultrasound-assisted extraction rate in the tested experimental conditions.The chosen extraction condition of microwave method was as follows:microwave power 60%,extracting time 7 minutes,50%ethanol,and ratio of solid to liquid 1∶45(g/mL).Therefore,microwave method was selected as the extraction method of total flavonoid measurement by UV spectrometry in citrus peels.The average recovery of the methods was 99.5%,and the method was satisfactorily used in determination of total flavonoids in citrus peels.

Key words：ultrasound;microwave;citrus peels;total flavonoids;UV spectrophotometry;the uniform design method

柑橘為蕓香科柑橘屬，原產(chǎn)于我國(guó)，全世界有80多個(gè)國(guó)家栽培柑橘，其產(chǎn)量居水果之首。柑橘皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)成分，它們具有抗氧化、抗癌、防止心血管疾病、消炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗菌和抗病毒等作用[1-5]。因此，測(cè)定其中黃酮的含量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

黃酮類化合物常見的測(cè)定方法有HPLC法[6-7]，分光光度法[8]，比色法[9]和近紅外反射光譜法[10]等。對(duì)總黃酮含量的測(cè)定，多采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系分光光度法，在510 nm下測(cè)定其吸光度，但操作比較煩瑣，用時(shí)較長(zhǎng)，體系相對(duì)復(fù)雜[11]。蘇東林[12]等認(rèn)為，以氯化鋁顯色法（275 nm）結(jié)果比較準(zhǔn)確，并經(jīng)過HPLC法檢驗(yàn)，而直接測(cè)定法（270 nm）結(jié)果次之，硝酸鋁顯色法（345 nm）結(jié)果相對(duì)稍差。

黃酮的提取是測(cè)定的關(guān)鍵因素之一，也是黃酮生產(chǎn)的主要環(huán)節(jié)。因此，研究黃酮的提取具有多方面的重要性。黃酮提取的影響因素很多，為了提高黃酮的生產(chǎn)工藝，增效減能，必須要對(duì)各影響因素進(jìn)行優(yōu)化。本文利用均勻設(shè)計(jì)法，通過對(duì)超聲波法和微波法提取柑橘皮中總黃酮的條件進(jìn)行比較研究，并以蘆丁為對(duì)照品，271 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，用紫外分光光度法測(cè)定了柑橘皮中的總黃酮。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

UV-2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；SB-3200型超聲波清洗器（超聲功率180W）：寧波新芝生物科技有限公司；AE240型雙量程分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；LWMC-201型微波化學(xué)反應(yīng)器（功率650 W）：南京旋光科技有限公司；JYL-350型料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；HG202-2A型電熱恒溫烘箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品（含量≥98%）：天津一方科技有限公司；無水乙醇（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備

準(zhǔn)確稱取干燥恒重的蘆丁對(duì)照品31.20mg，用50%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，得312 μg/mL對(duì)照品溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品溶液制備

將市售的新鮮柑橘，去肉留皮，將皮剪成小塊薄片于60℃干燥至恒重，用料理機(jī)粉碎成粉末，置于干燥器中備用。稱取一定質(zhì)量的柑橘皮粉末，加入一定濃度的乙醇溶液，分別進(jìn)行微波處理或超聲波處理，以相應(yīng)濃度的乙醇溶液為參比測(cè)定吸光度，必要時(shí)將樣品溶液稀釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將不同濃度的對(duì)照品溶液，在波長(zhǎng)271 nm處，以50%乙醇為參比，測(cè)定吸光度值A(chǔ)。以濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：A=0.02461C+0.04612（r＝0.9993）。蘆丁對(duì)照品濃度在6.2 μg/mL~56 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

黃酮類化合物在200 nm~400 nm區(qū)域內(nèi)存在2個(gè)主要吸收峰：峰帶Ⅰ220 nm~280 nm和峰帶Ⅱ300 nm~400 nm[13]。將對(duì)照品和樣品溶液分別進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)對(duì)照品溶液在260 nm和360 nm附近有最大吸收，樣品溶液在280 nm和320 nm附近有特征峰，見圖1。

由于提取溶液與對(duì)照品溶液的吸收光譜有一定差異，為兼顧對(duì)照品和樣品溶液的吸收特征，選擇271 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 提取條件的選擇

利用均勻設(shè)計(jì)法，選擇提取溫度、時(shí)間、乙醇濃度、料液比為超聲波提取的考察因素；選擇提取功率、時(shí)間、乙醇濃度、料液比為微波提取的考察因素；因素水平表分別見表1、表3。以新奇士橙皮為試樣，超聲波和微波試驗(yàn)方案和結(jié)果分別見表2、表4。

表1 超聲波提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasound extraction

表2 超聲波提取U10（108）擬水平均勻設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Ultrasonic extraction results of drafting level uniform desigh method

表3 微波提取因素水平表Table 3 Factors and levels of microwave extraction

表4 微波提取U10（108）均勻設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 4 Microwave extraction results of uniform design method

超聲提取是超聲波對(duì)液體中固體物質(zhì)作用時(shí)，產(chǎn)生空化效應(yīng)，造成生物細(xì)胞壁及整個(gè)生物體的破裂，加速溶劑進(jìn)入細(xì)胞。同時(shí)，超聲波的振動(dòng)作用強(qiáng)化了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，使化學(xué)成分快速進(jìn)入溶劑中，從而達(dá)到提取的目的[14]。微波提取是透過對(duì)微波透明的溶劑，到達(dá)植物物料的內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)溫度突然升高，連續(xù)的高溫使其內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁膨脹的能力，致細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)自由流出傳遞至周圍的溶劑中被溶解[15]。

從試驗(yàn)結(jié)果來看，微波提取耗時(shí)更短，且提取率更高，總體效果優(yōu)于超聲波。因此，本試驗(yàn)采用微波法作為總黃酮的提取方法，選擇微波提取的較優(yōu)工藝條件為：輻射功率60%，輻射時(shí)間7 min，乙醇濃度50%，料液比 1∶45 g/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取一定體積的微波樣品溶液于10 mL具塞比色管中，加相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，在波長(zhǎng)271 nm處，以相應(yīng)濃度的乙醇溶液作參比，測(cè)定其含量，重復(fù)6次，結(jié)果見表5。

表5 微波提取的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The precision experiment results of microwave extraction

由表5可知，微波的RSD為0.51%，表明儀器穩(wěn)定性較好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精確稱取一定質(zhì)量的新奇士橙皮粉末若干份，按所選擇的微波提取方案進(jìn)行操作，得到樣品溶液上機(jī)測(cè)定其含量，結(jié)果見表6。

表6 微波提取的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The repetition experiment results of microwave extraction

由表6可知，微波法的重復(fù)性較好。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精確稱取一定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品，加入到柑橘皮樣品中，并按所選擇的微波提取方案進(jìn)行操作，得到樣品溶液上機(jī)測(cè)定其含量，結(jié)果見表7。

表7 微波提取加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 The recovery experiment results of microwave extraction

由表7可知，微波法的平均加標(biāo)回收率為99.5%（RSD＝2.2%，n＝4）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取同一份微波樣品溶液，置于室溫下，間隔一定時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。在 0、0.5、3.5、6.0、30.5 h樣品溶液的吸光度分別為 0.551、0.550、0.546、0.546、0.541。結(jié)果表明，微波提取的樣品溶液在30 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.82%。

2.8 柑橘皮樣品中總黃酮含量的測(cè)定

選取市售的5種不同品種柑橘，按所選擇的微波提取方案測(cè)定其總黃酮含量，結(jié)果見表8。

表8 不同柑橘皮樣品中總黃酮含量結(jié)果Table 8 The total flavonoids content in different citrus peels(n=4)

3 結(jié)論

利用均勻設(shè)計(jì)法，對(duì)超聲波和微波提取柑橘皮中總黃酮的條件進(jìn)行研究并比較，微波法的總體提取率高于超聲波法。微波提取柑橘皮中總黃酮的較優(yōu)條件是：輻射功率60%，輻射時(shí)間7 min，乙醇濃度50%，料液比1∶45(g/mL)；結(jié)合紫外分光光度法測(cè)定了柑橘皮中總黃酮的含量。樣品制備比較簡(jiǎn)單，操作方便，快捷，彌補(bǔ)了氯化鋁顯色法的不足，結(jié)果較為滿意。本文研究的提取條件也為柑橘皮中總黃酮的開發(fā)和評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考。

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UV Spectrophotometric Measurement of Total Flavonoids in Citrus Peels

XU Xu-yao,XIAO Xu-feng,MEI Dan-dan,YU Bing-sheng*
(Chemistry Science and Technology School,Zhanjiang Normal University,Development Center for New Materials Engineering&Technology in Universities of Guangdong,Zhanjiang 524048,Guangdong,China)

2011-12-23

徐旭耀（1982—），男（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事色譜和光譜分析研究。

*通信作者