黨亞麗，張中健，閆小偉

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，浙江杭州310013）

蜂王漿產(chǎn)品中10-羥基-2-癸烯酸的穩(wěn)定性比較

黨亞麗，張中健，閆小偉

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，浙江杭州310013）

10-羧基-2-癸烯酸（10－HDA）是蜂王漿特有的不飽和脂肪酸，在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中特別規(guī)定了含量要求。采用納米技術(shù)制備納米脂質(zhì)體可提高其穩(wěn)定性，以包封率為評(píng)定指標(biāo),采用乙醇注入-超聲法制備了10-HDA納米脂質(zhì)體，并用液相色譜測(cè)定其中的10-HDA含量，比較5種蜂王漿產(chǎn)品中10-HDA的含量穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-HDA納米脂質(zhì)體包封率可達(dá)98.3%，同時(shí)其含量最為穩(wěn)定，而其它4種蜂王漿產(chǎn)品中10-HDA含量不穩(wěn)定，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。

10-HDA含量；蜂王漿產(chǎn)品；穩(wěn)定性；脂質(zhì)體

Abstract:10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA)is the special unstaturated fatty acid in royal jelly,which content is ruled in its quality.The lecithin as the main wall material,the 10-HDA nanoliposome was prepared by the ethanol injection-sonication method.Furthermore,five kinds of royal jelly product as the material,the content of 10-HDA was measured by HPLC,and then the 3 month-long stability experiment was carried out.Results showed that the envelope rate of 10-HDA may reach 98.3%using nanocapsule technology to prepare 10-HDA nanoliposome;simultaneously its content stability could be improved.While the 10-HDA content of other four kind of royal jelly production was unstable,the content became lower along with the time.

Key words：10-HDA content;royal jelly product;stability;nanoliposome

10-羧基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA）是蜂王漿特有的不飽和脂肪酸，占鮮王漿總量的1.4%~2.0%，是蜂王漿的標(biāo)志物，在蜂王漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中特別規(guī)定了王漿酸的含量要求。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蜂王漿優(yōu)等品中10-HDA含量應(yīng)大于1.6%，合格品應(yīng)大于1.4%[1]。日本從1980年起就采用了這一指標(biāo)，并規(guī)定進(jìn)口蜂王漿中王漿酸含量不得低于1.9%。

一直以來(lái)人們認(rèn)為10-HDA具有一定的熱穩(wěn)定性[2]，在高溫下其含量變化不明顯[3]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，10-HDA在蜂王漿產(chǎn)品中不穩(wěn)定，如蜂王漿口服液中的10-HDA穩(wěn)定性差[4]。李憲華[5]發(fā)現(xiàn)2001年~2002年在進(jìn)出口蜂王漿膠囊中10-HDA穩(wěn)定性差，這極可能在進(jìn)出口時(shí)受限，造成經(jīng)濟(jì)損失。和健[6]研究表明，軟膠囊成品冷藏時(shí)10-HDA的含量穩(wěn)定，室溫及高溫高濕條件下其含量下降明顯。但多年來(lái)，人們一直采用乙醚從新鮮王漿中抽提得到10-HDA，然后添加到蜂王漿產(chǎn)品中以提高10-HDA含量，對(duì)其穩(wěn)定性方面的研究很少。

納米脂質(zhì)體是由脂質(zhì)分子構(gòu)成的雙分子層囊泡，內(nèi)水相可以包埋水溶性物質(zhì)，雙分子層可以包埋脂溶性物質(zhì)。目前，Nafady等[7]制得了巴西蜂膠的β-環(huán)糊精包合物。納米蜂王漿最先在日本出現(xiàn)[8]，它是以蜂王漿凍干粉與油脂一起混合制成粒狀芯材，然后在其表面再包上一層被膜材料制成粒狀蜂王漿，可長(zhǎng)期保存，質(zhì)量穩(wěn)定。本文采用納米脂質(zhì)體將10-HDA包埋；并以5種蜂王漿產(chǎn)品為研究對(duì)象，采用液相色譜法對(duì)其中的10-HDA含量進(jìn)行測(cè)定，比較其在蜂王漿產(chǎn)品中的穩(wěn)定性，目前此方面研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

蜂王漿產(chǎn)品包括凍干粉、口服液、膠囊、含片；納米脂質(zhì)體制備所需材料：卵磷脂（EPC，生化試劑）；膽固醇：華東師范大學(xué)化工廠；吐溫80（化學(xué)純）；浙江省溫州華僑化學(xué)試劑有限公司；10-HDA晶體粗品：江山日行蜂業(yè)合作社。

1.1.2 儀器

高效液相色譜儀WATERS 2690；檢測(cè)器WATERS 996；分析柱 ZOBAX SB C184.6×250 mm；酶反應(yīng)器：自制；501型超級(jí)恒溫水?。荷虾?shí)驗(yàn)儀器廠；ZX98-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；上海有機(jī)研究所；VCX50型超聲處理器（20 kHz）：美國(guó) Sonics&Materials公司；CL20-B型冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.1.3 試劑

重蒸水、甲醇、磷酸二氫鉀、濃磷酸、偏磷酸、無(wú)水乙醇、內(nèi)標(biāo)物（對(duì)羥基苯甲酸甲酯）、10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%以上）。

1.2 10-HDA納米脂質(zhì)體的制備

1.2.1 原料提純

稱(chēng)取10-HDA晶體粗品5 g置于250 mL三角瓶中，加入50mL水溶解，置200r/min搖床中振蕩10min。用6 mol/L NaOH調(diào)溶液pH為10.0。振蕩搖勻后加入50 mL乙醚 (Ⅰ)置200 r/min搖床振蕩10 min提取雜質(zhì)，置分液漏斗中靜置3 h～4 h。取下層水液（乙醚層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收）用1∶1鹽酸調(diào)pH（Ⅱ）至2.0，搖勻，加入50 mL乙醚（Ⅱ）置200 r/min搖床搖勻，靜置過(guò)夜，充分提取10-HDA。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醚得10-HDA濃縮液，加入5 mL~10 mL乙醇溶解，濾紙過(guò)濾，去除不溶于乙醇的雜質(zhì)，置于平皿內(nèi)晾干即得10-HDA 粗提品[9]。

1.2.2 提純后原料的預(yù)處理

提純后的10-HDA仍有少許不溶解于水，用乙醇溶解原料后離心，除去不溶于乙醇的物質(zhì)，然后加卵磷脂和膽固醇，測(cè)定離心前后對(duì)10-HDA含量的影響。

1.2.3 脂質(zhì)體制備方法

采用乙醇注入-超聲法。稱(chēng)取卵磷脂（EPL）500 mg、膽固醇（Chol）100 mg、Tween 80300 mg及 50 mg癸烯酸晶體粗品，加入5 mL無(wú)水乙醇于55℃水浴至溶，邊攪拌邊用注射器快速將其注入50 mL 0.02 mol/L pH7.0磷酸緩沖液中，攪拌水化30 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇（45℃，真空度0.1 MPa，迅速冷卻，冰浴超聲處理4 min（脈沖 1s/1s），4℃靜置過(guò)夜，冷凍離心 30min（11000 g，4℃）后充入N2密封，置于冰箱冷藏保存[10]。

1.2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

評(píng)價(jià)脂質(zhì)體質(zhì)量的指標(biāo)有外觀、粒徑分布和包封率等，其中包封率是衡量脂質(zhì)體內(nèi)在質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

其中液體介質(zhì)中10-HDA含量的測(cè)定：采用正戊烷洗滌-HPLC法，即取5 mL納米脂質(zhì)體，加入5 mL正戊烷，漩渦混合3 min，2000 r/min離心5 min，取上層正戊烷液，重復(fù)操作一次，合并正戊烷液，氮?dú)獯蹈珊蟀凑諊?guó)標(biāo)樣品處理方法測(cè)定10-HDA的含量。

1.3 10-HDA測(cè)定方法及穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.1 樣品處理

稱(chēng)取蜂王漿產(chǎn)品0.2g，稱(chēng)準(zhǔn)至0.0002g置于25mL燒杯中，加預(yù)先混合1mL0.03mol/L鹽酸溶液+2mL水+7 mL乙醇的溶液，攪勻，裝入50 mL容量瓶，加25 mL乙醇，邊加邊輕輕搖動(dòng)，加10.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用乙醇定容，在漩渦混勻器上混合5 min，取出，3000 r/min離心 10 min 待測(cè)[11]。

1.3.2 測(cè)定方法

試樣經(jīng)乙醇處理，溶出10-HDA并沉淀蛋白質(zhì)，加入內(nèi)標(biāo)后用乙醇定容,離心，取上清液進(jìn)行測(cè)定。

液相色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流動(dòng)相為50%甲醇50%0.1%三氟乙酸；柱溫35℃；流速1.0 mL/min；運(yùn)行時(shí)間20 min；進(jìn)樣量2 μL（自動(dòng)進(jìn)樣）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定：精密稱(chēng)取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 10-HDA標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，加2.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用無(wú)水乙醇定容，分別進(jìn)樣2 μL，用峰面積比值計(jì)算，應(yīng)呈線性,求出校正因子F。

1.3.310 -HDA的計(jì)算

式中：F為校正因子；Ai為試樣中被測(cè)組分峰面積；As為試樣中內(nèi)標(biāo)峰面積；ms為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，g；mi為試樣質(zhì)量，g。

1.3 .4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將5種蜂王漿產(chǎn)品置于高溫高濕環(huán)境中（40±2）℃，（75±5）%保存3個(gè)月測(cè)定。各進(jìn)樣2μL，重復(fù)測(cè)定3次，取3次平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 校正因子測(cè)定結(jié)果

在選定的色譜條件下，將10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 5 個(gè)質(zhì)量濃度水平，每個(gè)質(zhì)量濃度水平進(jìn)樣3次，取峰面積平均值。10-HDA的質(zhì)量濃度在進(jìn)樣量為10 ng~1000 ng范圍內(nèi)與峰面積呈線性，校正因子F=1.287，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=159606x-691.43，相關(guān)系數(shù) r=0.998（n＝3）。

2.2 10-HDA含量的穩(wěn)定性

5種蜂王漿產(chǎn)品中10-HDA含量典型的色譜峰見(jiàn)圖1，其中D為凍干粉；K為口服液；J為膠囊；H為含片；N為納米脂質(zhì)體。穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蜂王漿產(chǎn)品中10-HDA穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The stability of 10-HDA in the product of royal jelly

由表1可見(jiàn)，前4種蜂王漿產(chǎn)品中10-HDA含量不穩(wěn)定，呈逐漸下降的趨勢(shì)。這可能是由于10-HDA的結(jié)構(gòu)中含有雙鍵、羧基和羥基，雙鍵可能發(fā)生不飽和脂肪酸的氧化；羧基可能會(huì)與氨基（美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物）反應(yīng)；羧基可能與多酚物質(zhì)的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)等，因此，10-HDA易受空氣、光線、水分和酸堿等影響產(chǎn)生穩(wěn)定性方面的問(wèn)題。

由表1計(jì)算可知，10-HDA晶體粗品純度為44.12%，離心后為44.44%，表明用酸處理后離心對(duì)10-HDA的含量影響不大，原料經(jīng)提純后純度為80.5%，因此選用離心處理用于納米脂質(zhì)體制備的原料。經(jīng)計(jì)算，載量為10%的10-HDA納米脂質(zhì)體的包封率為98.3%，3個(gè)月的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明10-HDA含量幾乎不變，說(shuō)明納米脂質(zhì)體可提高10-HDA在蜂王漿產(chǎn)品中的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

10-HDA納米脂質(zhì)體含量最為穩(wěn)定，而其它4種蜂王漿產(chǎn)品中10-HDA含量不穩(wěn)定，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 9697-2002蜂王漿[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社:1-11

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Comparison on the Stability of 10-Hydroxy-2-Decenoic Acid in Royal Jelly Product

DANG Ya-li,ZHANG Zhong-jian,YAN Xiao-wei
(Institute of Materia Medica,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,Zhejiang,China)

2011-12-20

浙江省醫(yī)科院藥物所資助項(xiàng)目（A11005S）

黨亞麗（1978—），女（漢），助理研究員，博士，主要從事保健食品檢測(cè)與研發(fā)工作。