沈穎，劉曉艷，2，白衛(wèi)東，2，趙文紅，2，錢敏

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州，510225)

2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州，510642)

荔枝酒釀造過程中氨基酸的變化*

沈穎1，劉曉艷1，2，白衛(wèi)東1，2，趙文紅1，2，錢敏1

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州，510225)

2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州，510642)

利用高效液相色譜法(HPLC)對不同發(fā)酵溫度的荔枝酒釀造過程中氨基酸含量的動態(tài)變化進行了分析研究。結(jié)果表明，荔枝汁和荔枝酒中均含有丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、谷氨酸、絲氨酸等14種氨基酸，其中，丙氨酸是荔枝汁和荔枝酒中的主體氨基酸，含量分別達1139.682 mg/L、341.049～412.161 mg/L。不同發(fā)酵溫度的荔枝酒釀造動態(tài)過程中，其游離氨基酸的種類和含量變化較大，且變化趨勢各異。不同貯藏方式對荔枝酒中氨基酸含量和種類影響也不同。通過比較，發(fā)酵溫度12℃優(yōu)于15℃，發(fā)酵溫度為15℃的荔枝酒中氨基酸含量在貯藏過程中變化幅度較大，不穩(wěn)定，且影響風(fēng)味的氨基酸較多。

荔枝酒，氨基酸，HPLC，發(fā)酵，動態(tài)變化

荔枝果酒是以野生或人工種的荔枝為原料發(fā)酵而成的低酒精度飲料，保留了水果原有的糖類、氨基酸、有機酸和礦物質(zhì)等成分。以荔枝全汁釀制的荔枝酒含有豐富的維生素、有機酸及含氮物質(zhì)，且保留了荔枝特有的風(fēng)味成分，既有陳釀的香味，又有水果原有的芳香，深受人們的喜愛。目前荔枝果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?jié)摿σ驯蝗藗兯J知，但是發(fā)展的步伐很慢，主要是因為荔枝果酒的風(fēng)味不佳，口感淡薄、尖酸、具有一定的苦澀感。而荔枝酒的風(fēng)味是衡量荔枝酒品質(zhì)的一個重要指標。其風(fēng)味成分十分豐富，主要有醇類、糖類、氮類、酸類、揮發(fā)性香氣物質(zhì)、酚類物質(zhì)及其他成分，且不同品種的荔枝酒所含的風(fēng)味成分也不盡相同[1］。

氨基酸是荔枝酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)，直接影響酒的口感品質(zhì)，氨基酸本身除了呈現(xiàn)酸、甜、苦、鮮等各種味道，如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等呈現(xiàn)甜味，谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺呈鮮味，色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸呈苦味，為荔枝酒提供了豐富飽滿的感官特征外，還與酒中的醇類、酯類、有機酸、羰基化合物和萜烯化合物等協(xié)同構(gòu)成了荔枝酒的特有風(fēng)味，并賦予了荔枝酒較高的營養(yǎng)價值[2-3］。本研究利用HPLC檢測了荔枝原酒和不同發(fā)酵方案釀制過程中荔枝酒氨基酸含量的變化，初步探討了荔枝酒中氨基酸形成的原理，以期為荔枝酒風(fēng)味物質(zhì)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀，安捷倫1100，Agilent Technologies;氨基酸分析柱，4.6 μm×150 mm 5-Micron，Agilent Technologies。

1.2 試劑

氨基酸混標 1nmol/μL(Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys)、衍生劑(OPA、FMOC)以及硼酸鹽緩沖溶液，均為安捷倫科技有限公司色譜純產(chǎn)品;NaOH、NaH2PO4(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司);乙腈、甲醇均為瑞典歐譜生高效液相色譜純產(chǎn)品。

1.3 測定方法

1.3.1 樣品前處理

取荔枝酒20 mL，3600 r/mim于25℃下離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3.2 色譜條件

流動相A:pH 7.8 NaH2PO4緩沖溶液(0.04 mol/L);流動相 B∶V(乙腈，ACN)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶40∶20;洗脫程序:T(min)/B(%):0/0;2.1/0;19.2/57;19.8/100;21.3/100;24.2/0;26/0;檢測波長:338 nm(OPA);262 nm(FMOC);柱溫:40℃;流速:2 mL/min。

1.4 荔枝酒釀造的工藝流程

荔枝→榨汁→加酶酶解→調(diào)整成分→滅酶→澄清→發(fā)酵→發(fā)酵結(jié)束→下膠澄清→過濾→貯藏→裝瓶方案一:發(fā)酵溫度12℃;方案二:發(fā)酵溫度15℃

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝酒中氨基酸測定方法分析

準確吸取1 nmoL/μL的氨基酸混標1 μL，衍生劑(OPA、FMOC)以及硼酸鹽緩沖溶液，設(shè)置程序進樣，進行柱前衍生，氨基酸標品的液相色譜圖見圖1。

圖1 氨基酸標品的液相色譜圖

選取5個不同濃度梯度的氨基酸標準溶液(1、3、5、7、9 nmol)，按色譜條件分別進行測定，各水平重復(fù)測定6次，以峰面積y對濃度x(mg/L)進行線性回歸計算，結(jié)果見表1。

表1 氨基酸標準曲線的回歸方程

表1結(jié)果顯示，線性試驗中氨基酸各組分濃度與各峰面積呈良好線性關(guān)系，除了亮氨酸外，其余15種氨基酸標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2值均大于0.99。精密度RSD%均低于2%，說明該方法精確、穩(wěn)定，可以滿足氨基酸的定量分析。以荔枝酒樣品為基底進行加標回收率試驗，在樣品中加入已知含量的氨基酸混標，按測定方法要求進行回收試驗，分析樣品回收率。結(jié)果表明，荔枝酒樣品氨基酸加標回收率均在82.88%～104.82%。說明該分析方法準確、可信并具有較高的靈敏度。

2.2 不同發(fā)酵方式對氨基酸含量的影響

2.2.1 不同釀造工藝對荔枝原酒中氨基酸含量的影響

表2 不同釀造工藝的荔枝原酒中的氨基酸含量 mg/L

表2表明，不同釀造工藝的荔枝原酒中氨基酸的種類大致相同，含量有所差異。發(fā)酵方案一:荔枝酒中總的氨基酸含量較高，達到847.676 mg/L;發(fā)酵方案二:氨基酸總量為720.798 mg/L，其中丙氨酸的含量最高，為412.261 mg/L和352.049 mg/L，分別占總氨基酸含量的48.6%和48.8%。荔枝酒中游離氨基酸主要為L-丙氨酸。L-丙氨酸具有特殊的甜味，能夠有效地改善有機酸的酸味，使荔枝酒風(fēng)味更加和諧，其含量高低對荔枝酒口感及風(fēng)味有直接影響[4］。

2.2.2 不同貯藏方式對氨基酸含量的影響

表3顯示，不同貯藏方式對荔枝酒中氨基酸含量和種類影響不同。其中，Asp、Thr、Lle在原酒中未檢查到含量，但在貯藏后檢測到了含量;Met在原酒中檢測到了含量，但在不同的貯藏條件下，未檢測到含量;His在原酒中含量為144.021 mg/L，經(jīng)常溫瓶儲、冰箱瓶儲和罐儲，含量減少到2.427、1.714、1.221 mg/L。其中，天冬氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸呈甜味，組氨酸呈苦味，在荔枝酒貯藏過程中，甜味物質(zhì)增加，而苦味物質(zhì)含量降低。表明經(jīng)過酒精發(fā)酵后的蘋果酸乳酸發(fā)酵以及荔枝酒的后熟過程，相當數(shù)量的氨基酸被釋放到了酒中，能夠使荔枝酒中的不良風(fēng)味物質(zhì)減少，使其風(fēng)味口感增加。

表3 不同貯藏方式的荔枝酒中的氨基酸含量 mg/L

2.3 荔枝酒發(fā)酵過程中氨基酸的動態(tài)變化

根據(jù)氨基酸含量的變化趨勢，將荔枝酒中氨基酸分為3組:1.天冬氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、異亮氨酸;2.丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸;三、組氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸。以3組氨基酸含量的變化趨勢，研究不同發(fā)酵方案對氨基酸變化的影響。

2.3.1 天冬氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、異亮氨酸的變化

圖2顯示，不同的發(fā)酵方案對荔枝酒中甲硫氨酸、絲氨酸和異亮氨酸含量變化趨勢的影響相似，甲硫氨酸、絲氨酸和異亮氨酸的含量先減后增再減，最后趨于平緩，變化規(guī)律基本一致。天冬氨酸的含量變化略有不同，其含量先增再減，最后趨于平緩。表明不同的氨基酸在釀造過程中含量的變化也不同。在荔枝酒的酒精發(fā)酵過程中，釀酒酵母可以利用氨基酸合成結(jié)構(gòu)性和功能性蛋白質(zhì)，用來生長酵母菌體及合成酶類，也可以作為氮源使用，氨基酸被酵母細胞分解，分子中的氮常以氨的形式釋放出來用作合成細胞含氮組織[5］。所以發(fā)酵后酒體中的氨基酸總量會大量減少。天冬氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸作為酵母主要的營養(yǎng)氮源被釀酒酵母快速利用，且在發(fā)酵后期沒有生成，因此，四種氨基酸在發(fā)酵后期含量較低，幾乎完全被消耗且趨于平緩。

圖2 荔枝酒釀造過程中天冬氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和異亮氨酸氨基酸的變化

2.3.2 丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸的變化

圖3表明，不同的發(fā)酵方案對荔枝酒中丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸含量的影響不同。其中，不同發(fā)酵方案在發(fā)酵前對氨基酸含量的影響不明顯，發(fā)酵結(jié)束后，丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸含量的降低，并趨于平緩;發(fā)酵方案二中，酪氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸在發(fā)酵結(jié)束后變化較大。表明不同的氨基酸在釀造過程中含量變化不同，釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中利用了這些氨基酸，但利用程度沒有圖2中天冬氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、異亮氨酸徹底。由于發(fā)酵前果汁中天門冬氨酸、異量氨酸的含量比較高，足夠供酵母生長發(fā)酵所需，同時其他氮源會轉(zhuǎn)化生成谷氨酸，導(dǎo)致谷氨酸發(fā)酵后含量相對較高。發(fā)酵結(jié)束后及儲藏過程中，丙氨酸含量最高，其次是谷氨酸;苯丙氨酸和亮氨酸含量較低，其中丙氨酸呈甜味，谷氨酸呈鮮味，苯丙氨酸和亮氨酸均呈苦味。纈氨酸在發(fā)酵方案二中變化趨勢不穩(wěn)定，可能是當酒醪中的α-氨基酸缺乏或比例不合理時，誘導(dǎo)酵母自身合成一些纈氨酸，產(chǎn)生大量的雙乙酰等物質(zhì)，此過程會破壞酒的品質(zhì)，使其風(fēng)味欠缺[6-8］。

圖3 荔枝酒釀造過程中丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸的變化

2.3.3 組氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的變化

從圖4可以看出，荔枝汁中組氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的含量很少，甚至為零，表明這幾種氨基酸基本不被釀酒酵母所利用。組氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸在釀造過程中含量變化較大，組氨酸在發(fā)酵前，含量趨于零，發(fā)酵后，其含量在后續(xù)步驟中變化不規(guī)律，且不同的發(fā)酵方案對組氨酸含量的影響不同，方案一中組氨酸在澄清過濾后含量接近零，組氨酸呈苦味，澄清過濾后分解消失，從而減少了荔枝酒中苦味物質(zhì)。荔枝汁中不含半胱氨酸，荔枝酒含有少量的半胱氨酸，半胱氨酸在發(fā)酵方案一中，在發(fā)酵時檢測了含量(1.67 mg/L)，其后半胱氨酸消失;發(fā)酵方案二在發(fā)酵時檢測到微弱的半胱氨酸，在儲藏4個月時再次檢測到含量(2.92 mg/L)，其他過程未檢測到半胱氨酸?？赡苁怯捎诖藭r荔枝酒中氨基酸被利用，氮素營養(yǎng)貧乏，會有利于含硫的氨基酸合成半光氨酸。甘氨酸在發(fā)酵方案一時，未檢測到含量，方案二發(fā)酵后，在儲藏4個月時檢測到甘氨酸(109.3 mg/L)，此時蘇氨酸含量大量減少，會直接代謝生成甘氨酸，導(dǎo)致甘氨酸含量增多。其他處理未檢測到甘氨酸。精氨酸在發(fā)酵方案一時，未檢測到含量，方案二發(fā)酵后，在儲藏1個月時檢測到精氨酸，且含量較高(790.3 mg/L)，其后含量變?yōu)榱?，精氨酸具有苦味和霉味，在荔枝汁及荔枝酒中含量較少，從而增加了酒的感官品質(zhì)。表明荔枝酒中組氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的含量不僅受發(fā)酵方案即發(fā)酵溫度的影響，也受其他處理的影響，且發(fā)酵方案二中氨基酸在儲藏過程中不穩(wěn)定[9-10］。

圖4 荔枝酒釀造過程中組氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的變化

3 結(jié)論與討論

通過HPLC分析荔枝汁和荔枝酒中16種游離氨基酸的含量，并對荔枝酒釀造過程中氨基酸變化趨勢進行了研究，可以得出以下結(jié)論:

(1)對荔枝酒中氨基酸的測定方法進行了分析，結(jié)果表明:16種氨基酸的濃度與各峰面積呈良好線性關(guān)系，由樣品精密度及荔枝酒氨基酸加標回收率試驗來確定該方法的靈敏度、準確性，測定的RSD值均低于2.0%。加標回收率均在82.88%～104.82%，說明該分析方法準確、可信并具有較高的靈敏度。

(2)荔枝汁和荔枝酒中均含有丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、谷氨酸、絲氨酸等14種氨基酸，其中富含8種必需氨基酸。L-丙氨酸是荔枝汁中和荔枝酒的主體氨基酸，含量分別達1139.682、341.049～412.161 mg/L。不同發(fā)酵方式釀造的荔枝酒，其游離氨基酸的種類大致相同，但其含量有所差異，即發(fā)酵溫度影響荔枝酒中游離氨基酸含量。且不同貯藏方式的荔枝酒中氨基酸含量和種類影響也不同。

(3)在荔枝酒釀造的動態(tài)過程中，荔枝酒中游離氨基酸種類和含量變化較大。其中，甲硫氨酸、絲氨酸和異亮氨酸含量變化趨勢的影響相似，且作為酵母主要的營養(yǎng)氮源被釀酒酵母快速利用，幾乎被完全消耗。丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸在發(fā)酵過程中被酵母部分利用，發(fā)酵結(jié)束后及儲藏過程中，丙氨酸含量最高，其次是谷氨酸，苯丙氨酸和亮氨酸含量較低;丙氨酸具有特殊的甜味，能夠有效地改善有機酸的酸味，使荔枝酒風(fēng)味更加和諧，其含量高低對荔枝酒口感及風(fēng)味有直接影響，谷氨酸呈鮮味，苯丙氨酸和亮氨酸均呈苦味。纈氨酸可產(chǎn)生雙乙酰等物質(zhì)，對風(fēng)味有較大影響。

荔枝汁中組氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的含量很少，甚至為零，表明這幾種氨基酸基本不被釀酒酵母所利用，且在釀造過程中含量變化較大，甚至又生成此氨基酸。

(4)發(fā)酵溫度對氨基酸含量影響頗大，從而影響其風(fēng)味及口感，整體上看，發(fā)酵方案二(15℃)中氨基酸含量在貯藏過程中變化幅度較大，不穩(wěn)定，且生成苦味和澀味的氨基酸較多。因此，從荔枝酒中氨基酸含量以及其風(fēng)味這一方面考慮，故發(fā)酵方案一(12℃)優(yōu)于發(fā)酵方案二(15℃)，即荔枝酒適宜低溫發(fā)酵。

本試驗通過檢測工廠中兩種發(fā)酵方式的荔枝酒中氨基酸的種類和含量，以及發(fā)酵過程及貯藏過程中氨基酸的變化，以期初步探討氨基酸在發(fā)酵過程中的代謝原理，但文章并未對其他工藝參數(shù)對荔枝酒風(fēng)味物質(zhì)的影響進行研究，也未對風(fēng)味物質(zhì)代謝過程進行代謝監(jiān)控，弄清荔枝酒發(fā)酵過程中氨基酸變化與多種酶學(xué)反應(yīng)的相關(guān)性，后期實驗可深入研究發(fā)酵過程中氨基酸的代謝機理，以及合成氨基酸的關(guān)鍵酶類，并對關(guān)鍵酶類進行深入的分析，弄清氨基酸的合成途徑。

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ABSTRACTThe variation of amino acids during the brewing process of litchi wine at different fermentation temperature were studied by high performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the lychee juice and litchi wine both contained 14 kinds of amino acids，such as alanine，threonine，valine，glutamic acid，serine，and so on.Among them，L-alanine was the main amino acid and its content reached 1139.682 mg/L and 341.049～412.161 mg/L in lychee juice and litchi wine respectively.During the dynamic brewing process of litchi wine at different temparature，the contents and types of free amino acids were varied with different trend.Different storage way had different impact on types and content of amino acid.Fermentation temperature influenced free amino acid content of litchi wine，and 12℃ was better than 15℃.The amino acids contents of litchi wine fermentated at 15℃changed obviously and unsteadily，and contained more amino acids that influenced the flavor.

Key wordslitchi wine，amino acid，HPLC，fermentation，dynamic variation

Study on Variation of Amino Acid During Brewing Process of Litchi Wine

Shen Ying1，Liu Xiao-yan1，2，Bai Wei-dong1，2，Zhao Wen-hong1，2，Qian Min1
1(College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China)
2(College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

碩士研究生(白衛(wèi)東教授為通訊作者，E-mail:whitebai2002@ybhoo.com.cn)。

*廣州市科技局科技項目(2010Z1-E021);廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研項目(2011B090400065);國家星火計劃項目(2010GA781001，2011GA780013)

2011-12-13，改回日期:2012-03-20