張志斌，顏日明，曾慶桂，汪涯，朱篤，

1(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌，330022)

2(宜春學(xué)院江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春，336000)

用于微生物油脂發(fā)酵的木薯淀粉水解工藝的優(yōu)化*

張志斌1，顏日明1，曾慶桂1，汪涯2，朱篤1，2

1(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌，330022)

2(宜春學(xué)院江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春，336000)

為了提高木薯淀粉的發(fā)酵產(chǎn)脂能力，采用正交實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)法對(duì)木薯淀粉酶法水解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明α-淀粉酶量、糖化酶量和液化溫度對(duì)木薯淀粉水解有顯著影響。當(dāng)?shù)矸勖噶繛?56 U/g，糖化酶量為602 U/g，液化溫度為92°C，其水解DE值達(dá)到97.3%。以該水解液進(jìn)行皮狀絲胞酵母B3(T.cutaneum B3)油脂發(fā)酵時(shí)，其生物量和油脂產(chǎn)量分別為16.38 g/L和7.22 g/L，比葡萄糖作為碳源的生物量和油脂產(chǎn)量高46.25% 和41.12%，利用木薯淀粉水解液作為新型發(fā)酵碳源生產(chǎn)微生物油脂是一種理想的途徑。

微生物油脂，木薯淀粉水解液，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，均勻設(shè)計(jì)，DE值

木薯為多年生植物，廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是世界三大薯類之一。木薯的塊根中含30%的淀粉，而木薯干含有70%的淀粉，有“淀粉之王”的美譽(yù)，并廣泛應(yīng)用于食品、飲料、糖果、藥品及化妝品行業(yè)[1］。近些年來非糧作物在生物降解材料、生物質(zhì)燃料生產(chǎn)方面也呈現(xiàn)新的應(yīng)用前景[2-3］。有關(guān)利用木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇和微藻油脂有較多報(bào)道[4-6］，而利用木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂報(bào)道較少[7］。木薯淀粉可通過水解反應(yīng)生成含有醛基和羰基的淀粉糖，如葡萄糖、麥芽糖和低聚糖等，這些淀粉糖可作為一種廉價(jià)的碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)中。

目前，木薯淀粉制糖工業(yè)生產(chǎn)中，淀粉的水解度較低，維持在40%～45%范圍之內(nèi)，導(dǎo)致生產(chǎn)能耗高，成本高[8］。減少高溫耗能，降低水解成本是木薯淀粉生產(chǎn)行業(yè)工業(yè)化亟待解決的問題。淀粉水解液工業(yè)方法已有很多，如酸法、酸酶法、全酶法等。而有關(guān)木薯淀粉水解的研究主要集中在單酶酶解方面。為了提高液化、糖化效率，袁建微等采用機(jī)械活化結(jié)合酶法進(jìn)行木薯淀粉糖化，最終使得木薯淀粉的水解度提高到64.41%[9］;魏愛麗等研究了中溫α-淀粉酶水解木薯淀粉的工藝條件研究，確定了中溫α-淀粉酶水解木薯淀粉的最佳工藝條件，葡萄糖糖得率是46.94%[10］。而雙酶協(xié)同水解木薯淀粉工藝也有研究報(bào)道，但其水解率僅為50%[11］。本課題選用α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同酶解木薯淀粉，通過均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化兩種酶的酶解條件來提高水解率，并觀察木薯淀粉水解液替代葡萄糖培養(yǎng)皮狀絲胞酵母B3(T.cutaneum B3)對(duì)其生物量和油脂積累的影響，為尋找廉價(jià)替代碳源、降低微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)成本提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

木薯淀粉(100目過篩)，由江西宜豐木薯加工廠提供;α-淀粉酶(50000 u/g)，購(gòu)自連云港華瑞化工有限責(zé)任公司，糖化酶(100000 U/g)，購(gòu)自無錫市雪梅酶制劑科技有限公司。

T.cutaneum B3由本實(shí)驗(yàn)室篩選并經(jīng)誘變選育而得。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L，酵母提取物1.0 g/L，NH4NO30.5 g/L，KH2PO40.75 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 6.0。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L，酵母提取物1.0 g/L，NH4NO30.5 g/L，KH2PO40.75 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，初始 pH 6.0。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:碳源，不同濃度葡萄糖或木薯淀粉水解液(其濃度以其含還原糖濃度計(jì))，酵母提取物 1.0 g/L，NH4NO30.5 g/L，KH2PO40.75 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，初始pH 6.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液的制備

將活化的菌種從斜面培養(yǎng)基中挑取適量，接入含有50 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h，溫度28℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.3.2 發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)

將種子液按5%的接種量轉(zhuǎn)接于含有80 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，進(jìn)行搖瓶振蕩培養(yǎng)，溫度28℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.3.3 木薯淀粉水解工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

木薯淀粉水解液制備主要包括液化和糖化兩個(gè)獨(dú)立過程，因此利用正交試驗(yàn)分別研究不同因素對(duì)這兩個(gè)過程的影響，實(shí)驗(yàn)所選的水解淀粉濃度為20%。

1.3.3.1 木薯淀粉液化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表來考察α-淀粉酶量、液化時(shí)間、液化溫度等3個(gè)因素對(duì)木薯淀粉液化的影響，以相對(duì)黏度(ηr)為考核指標(biāo)，ηr越小，說明液化越徹底，實(shí)驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 木薯淀粉液化正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.3.2 木薯淀粉糖化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表來考察糖化酶量、糖化時(shí)間、糖化溫度等3個(gè)因素對(duì)木薯淀粉糖化的影響，以還原糖含量(DE)為考核指標(biāo):

DE/%=(還原糖濃度/總糖濃度)×100

DE越大，說明糖化越完全。實(shí)驗(yàn)的因素水平見表2。

表2 木薯淀粉糖化正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.3.3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)木薯淀粉液化和糖化正交試驗(yàn)結(jié)果，以DE值為指標(biāo)，選擇淀粉酶量濃度X1、糖化酶量濃度X2、液化溫度X33個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步的均勻?qū)嶒?yàn)，每個(gè)因素取8個(gè)水平，采用U8*(85)均勻表[12］進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4 淀粉水解液相對(duì)黏度測(cè)定

將烏氏黏度計(jì)垂直固定于(25±0.5)℃恒溫水槽中，將不同液化條件下的淀粉水解液稀釋20倍，測(cè)出其在烏氏黏度計(jì)中的流出時(shí)間(t)，重復(fù)測(cè)量幾次，直到3次讀數(shù)偏差不超過0.2 s，取t的平均值。以1.0%木薯淀粉溶液為參照，按式(1)計(jì)算相對(duì)黏度[13］:

式(1)中，ηr表示相對(duì)黏度;t和t0分別表示木薯淀粉水解液和木薯淀粉溶液的流出時(shí)間(s)。

1.3.5 生物量的測(cè)定

通過4000 r/min離心10 min，收集沉淀并蒸餾水洗滌菌體1～2次，60℃烘至恒重，準(zhǔn)確稱重。

1.3.6 還原糖檢測(cè)方法

采用 DNS 法(3，5-二硝基水楊酸法)[14］。

1.3.7 微生物油脂的提取

油脂提取及測(cè)定:采用索氏提取法。將烘干后的菌體研成粉末后裝入索氏提取器，石油醚加熱回流提取8 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚，真空干燥至恒重即得油脂，稱重[15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯淀粉液化工藝優(yōu)化結(jié)果

木薯淀粉液化工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表3和表4。可以看到，α-淀粉酶量和液化溫度對(duì)木薯淀粉的液化有顯著影響。初步實(shí)驗(yàn)表明，在給定范圍內(nèi)，隨著α-淀粉酶量的增加，淀粉液化程度也明顯增加，表現(xiàn)為相對(duì)黏度的下降。液化溫度偏高或偏低都對(duì)α-淀粉酶催化反應(yīng)產(chǎn)生影響，在90℃時(shí)木薯淀粉液化比較好，而液化時(shí)間則以30 min較好(表3)。

表3 木薯淀粉液化工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 木薯淀粉液化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2 木薯淀粉糖化工藝優(yōu)化結(jié)果

木薯淀粉糖化工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表5和表6。與液化過程不同，影響木薯淀粉糖化過程的主要因素只有糖化酶量(表6)。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，糖化酶量為1000 U/g時(shí)，木薯淀粉水解程度較高(表5)。而糖化溫度和糖化時(shí)間對(duì)木薯淀粉的糖化沒有顯著影響，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，糖化溫度和糖化時(shí)間分別為60℃和30 min是較好的糖化工藝條件。

表5 木薯淀粉糖化工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 木薯淀粉糖化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3 木薯淀粉水解均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

上述正交試驗(yàn)結(jié)果初步表明，α-淀粉酶量、糖化酶加量和液化溫度對(duì)木薯淀粉的水解具有顯著影響。為了更進(jìn)一步細(xì)化木薯淀粉水解工藝，對(duì)淀粉酶加量、糖化酶加量和液化溫度等3個(gè)關(guān)鍵做了進(jìn)一步的均勻優(yōu)化設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表7所示。

表7 木薯淀粉水解均勻設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS軟件數(shù)據(jù)處理，采用向后剔除法逐步回歸分析，得出回歸方程:Y=0.025 X1+0.096 X2+0.93 X3+1.01×10-5 X1X2-3.36×10-4X1X3-1.12×10-3X2X3-1.57，相關(guān)性系數(shù) R2=0.982，模型回歸方差分析顯著性水平 Sig.=0.002＜0.01，說明回歸方程變量間關(guān)系是極顯著的(表8)。對(duì)應(yīng)的最優(yōu)條件為:淀粉酶量為756 u/g，糖化酶量為602 u/g，液化溫度為92°C。我們以此條件，對(duì)木薯淀粉水解工藝進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明優(yōu)化條件下的DE值達(dá)到97.3%。

表8 均勻試驗(yàn)因素回歸分析

2.4 木薯淀粉與葡萄糖的油脂發(fā)酵比較

為了進(jìn)一步考察木薯淀粉水解液作為碳源進(jìn)行T.cutaneum B3微生物油脂發(fā)酵的特性，分別以葡萄糖和木薯淀粉水解液為發(fā)酵碳源，在不同還原糖濃度(10～70 g/L)下，對(duì)T.cutaneum B3的菌體生長(zhǎng)和油脂積累情況進(jìn)行了比較。從圖1可以看到，隨著還原糖濃度的增加，菌體的生物量和油脂產(chǎn)量均呈逐步上升趨勢(shì)。同時(shí)還可以看到，以T.cutaneum B3進(jìn)行微生物油脂發(fā)酵，不管是菌體生長(zhǎng)還是油脂產(chǎn)量，木薯淀粉水解液明顯要優(yōu)于葡萄糖。另外從T.cutaneum B3利用不同碳源的發(fā)酵過程也可以看出，在優(yōu)化工藝條件下處理的木薯水解液，其菌體生物量和油脂總量均有很大提高，在以木薯淀粉水解液為碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，144 h的生物量和油脂產(chǎn)量分別為16.38 g/L和7.22 g/L，比葡萄糖作為碳源的生物量和油脂產(chǎn)量分別提高了46.25% 和41.12%(圖2)。因此，選用木薯淀粉水解液作為T.cutaneum B3進(jìn)行微生物油脂發(fā)酵的碳源比葡萄糖作為碳源更具優(yōu)勢(shì)，也會(huì)具有更好的經(jīng)濟(jì)效益。

圖1 葡萄糖及木薯淀粉水解液對(duì)T.cutaneum B3生物量和油脂產(chǎn)量的影響

圖2 T.cutaneum B3利用不同碳源的發(fā)酵過程比較

3 結(jié)論

近年來，利用淀粉水解液發(fā)酵培養(yǎng)微生物生產(chǎn)成品的研究很多，趙宗保等利用菊粉水解液及菊芋塊莖提取物水解液生物煉制微生物油脂，產(chǎn)量可達(dá)39.6 g/L，干菌體油脂含量為 56.5%[16］。Wei等[5］利用廉價(jià)木薯淀粉水解液作為有機(jī)碳源培養(yǎng)小球藻，與用葡萄糖作為有機(jī)碳源相比[6］，其生物量和油脂含量分別提高了42.3% 和21.6%。本實(shí)驗(yàn)室以木薯淀粉水解液為碳源對(duì)T.cutaneum B3發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)木薯淀粉水解液對(duì)菌體生物量和油脂積累皆具有良好的效果[7］。這些研究結(jié)果證明價(jià)格低廉的淀粉在生物燃料領(lǐng)域具有的廣泛應(yīng)用前景，也為非糧糖質(zhì)原料的再利用開辟了一條新途徑。

本試驗(yàn)利用α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同酶解木薯淀粉，得到了較好的水解效果。液化條件為淀粉量20%、淀粉酶量為756 u/g、液化時(shí)間30 min、液化溫度為92℃;糖化條件為糖化酶量為602 u/g、糖化時(shí)間30 min、糖化溫度60℃。在此條件下，水解液中的DE值達(dá)到97.3%。在此基礎(chǔ)上探討了木薯淀粉水解液作為碳源對(duì)T.cutaneum生物量和油脂積累的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以木薯淀粉水解液作為碳源培養(yǎng)T.cutaneum B3，木薯淀粉水解液生物量和油脂產(chǎn)量分別為16.38 g/L和7.22 g/L，比葡萄糖作為碳源的生物量和油脂產(chǎn)量高46.25% 和41.12%。這些數(shù)據(jù)表明木薯淀粉水解液替代葡萄糖作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基有較好的工業(yè)發(fā)展前景，也對(duì)降低微生物油脂生產(chǎn)成本具有重要參考價(jià)值。

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ABSTRACTIn order to improve the lipid production of cassava starch，the process of cassava starch hydrolysis(CSH)was optimized using orthogonal experimental design and Uniform design.The results showed that the content of α-amylase and glucoamylase and the liquefaction temperature significantly influenced cassava starch amylolysis.The dextrose equivalent value was up to 97.3%when content of α-amylase and glucose amylase and liquefaction temperature were 756 u/g，602 u/g and 92℃，respectively.While the CSH was used as a carbon source，the biomass and total lipid content of Trichosporon cutaneum were 16.38g/L and 7.22 g/L respectively，which increased by 46.25%and 41.12%as compared with those using glucose as a carbon source.Therefore，cassava starch hydrolysis，as a novel carbon source，is an ideal route to produce microbial lipid.

Key wordsmicrobial lipid，cassava starch hydrolysis，orthogonal experimental design，uniform design，dextrose equivalent value

Study on Hydrolysis Process of Cassava Starch Used for Microbial Lipid Fermentation

Zhang Zhi-bin1，Yan Ri-ming1，Zeng Qing-gui1，Wang Ya2，Zhu Du1，2
1(Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropic Plant Resources of Jiangxi Province，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China)
2(Key Laboratory for Research on Active Ingredients in Natural Medicine of Jiangxi Province，Yichun University，Yichun 336000，China)

碩士，實(shí)驗(yàn)師(E-mail:zzbbio@163.com)。

*國(guó)家863計(jì)劃(2012AA021205);江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃(060002);江西省高校產(chǎn)學(xué)研落地計(jì)劃資助

2011-11-14，改回日期:2012-04-06