王濤，趙東，游玲，周宇科，王松，馮瑞章，馮學(xué)愚

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)

2(宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)

3(五糧液股份有限公司技術(shù)中心，四川宜賓，644000)

濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中產(chǎn)酯化酶的霉菌多樣性*

王濤1，2，趙東3，游玲2，周宇科2，王松1，2，馮瑞章2，馮學(xué)愚2

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)

2(宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)

3(五糧液股份有限公司技術(shù)中心，四川宜賓，644000)

對分離自宜賓多糧濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中的135株霉菌產(chǎn)酯化酶的能力進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)40株菌具備產(chǎn)生酯化酶的能力。其中以來自窖房的最多(34株)，分離自糟醅次之(4株)，其余為曲藥(1株)、曲房(1株)。通過對這40株霉菌開展的基于ITS nu-rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其分屬于Penicillium、Aspergillus、Emericella、Rhizopus、Cladosporium、Mucor等6個屬，以 Penicillium(19株)和 Aspergillus(13株)為主要類群。結(jié)果顯示，宜賓多糧濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中具備大量產(chǎn)酯化酶能力的霉菌，而且這些霉菌存在較為豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。

濃香型白酒，霉菌，ITS nu-rDNA，酯化酶

濃香型白酒的釀造是一種固態(tài)、厭氧的半自然發(fā)酵過程，依賴于生產(chǎn)環(huán)境、曲藥、窖泥內(nèi)眾多微生物的協(xié)同參與，機(jī)理復(fù)雜[1］。以乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯為代表的4大酯類物質(zhì)是濃香型白酒復(fù)雜的呈香呈味物質(zhì)中的主要呈香物質(zhì)[2］。在窖內(nèi)發(fā)酵過程中，上述酯類物質(zhì)由有機(jī)酸和乙醇在酯化酶的催化下生成，所以酯化酶在多糧濃香型白酒釀造中扮演著重要角色，同時，酯化酶也被用于其他食品領(lǐng)域的增香[3-4］，有廣泛的應(yīng)用前景。

目前已知的在濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中產(chǎn)生酯化酶的菌株主要為酵母菌和霉菌，而霉菌以紅曲霉、根霉和毛霉等為主[5］。同時，關(guān)于濃香型白酒釀造相關(guān)霉菌產(chǎn)酯化酶的研究開展較少，僅局限于對1至數(shù)株霉菌產(chǎn)酯化酶的能力或條件進(jìn)行研究[6-7］，尚未見對濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中產(chǎn)酯化酶霉菌較為系統(tǒng)的研究報告。

宜賓為中國濃香型白酒的主要產(chǎn)區(qū)，對其濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中具備產(chǎn)生酯化酶能力的霉菌多樣性開展較為系統(tǒng)的研究，有利于進(jìn)一步認(rèn)識釀造環(huán)節(jié)中微生物區(qū)系對濃香型白酒釀造的影響，為闡明發(fā)酵機(jī)理、改進(jìn)生產(chǎn)工藝、穩(wěn)定或提高優(yōu)質(zhì)白酒產(chǎn)量具有重要意義。同時，這些霉菌也是一類重要生物資源，具有潛在的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

分離自窖泥、糟醅、窖房、曲房和曲藥(宜賓多家規(guī)模以上多糧濃香型白酒企業(yè))，經(jīng)過菌落特征和顯微鏡下孢子(菌絲)特征去除冗余的135株霉菌(窖泥1株、糟醅19株、窖房空氣104株、曲藥5株、曲房空氣6株)。

1.1.2 儀器試劑

PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品;菌株DNA提取、ITS 片段擴(kuò)增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品(Sangon);其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酯化酶能力檢測

[8］配制產(chǎn)酯化酶檢測平板。保存菌株活化后，制備孢子懸液(調(diào)整濃度107個/mL)，點接10 μL孢子懸液于檢測平板，36℃恒溫培養(yǎng)4～6 d，檢測菌落(d)及其周圍透明圈(D)的直徑，計算D/d值。

1.2.2 產(chǎn)酯化酶霉菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)文獻(xiàn)[9］提供的方法適當(dāng)修改，提取霉菌基因組DNA后，PCR擴(kuò)增ITS片段。引物ITS 1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和 ITS 4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照White等的方法進(jìn)行[9］。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)純化并測序，測序長度500～700bp，所得序列上傳至GenBank，序列號在JN226905～JN227005之間。所得序列用Blast在線進(jìn)行相似性分析，用ClustalX按照最大同源性的原則進(jìn)行比對，采用Kimura-2[10］計算序列相似值;采用 ClustalX進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建并用Mega 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建、編輯與保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌產(chǎn)酯化酶能力分析

供試的135株霉菌中有40株(占供試菌株總數(shù)的29.63%)顯示出產(chǎn)酯化酶的能力，其水解圈直徑與菌落直徑之比(D/d)在1.03～5.00(如表1)。40株中有34株來自于窖房空氣(占窖房空氣樣品供試菌株總數(shù)的32.69%)，4株來自于糟醅(占糟醅樣品供試菌株總數(shù)的21.05%)，另外2株分別來自于曲藥和曲房空氣樣品(分別占其供試菌株的20.00%和16.67%)。上述數(shù)據(jù)表明，從宜賓濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中分離得到的霉菌中有相當(dāng)部分都具備產(chǎn)酯化酶的能力。而且，分離自窖房空氣的霉菌中產(chǎn)酯化酶的菌株無論從絕對數(shù)量還是相對數(shù)量均遠(yuǎn)高于其余3個樣品。

從供試霉菌產(chǎn)酶能力來看，D/d在1.03～5.00，其中分離自窖房空氣的J8M-40菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)(D/d值達(dá)到了5.00)。D/d＞1.5的10株菌中，除SZ8M-16(D/d為2)來自于糟醅樣品外，其余9株都來自窖房空氣(占窖房空氣中具備產(chǎn)酯化酶能力菌株數(shù)量的26.47%)。這表明具備較強(qiáng)產(chǎn)酯化酶能力的霉菌主要分布在窖房空氣中。

2.2 產(chǎn)酯化酶霉菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

40株產(chǎn)酯化酶霉菌的ITS nu-rDNA序列與GenBank中對應(yīng)菌株的相似度在97%～100%，其中僅1條與數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)序列的相似度為97%，其余均在98%以上，還有有8條序列與對應(yīng)菌株的相似度達(dá)100%。結(jié)合序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(如圖1)，40株產(chǎn)酯化酶霉菌分屬于 Penicillium、Aspergillus、Emericella、Rhizopus、Cladosporium、Mucor等6個屬(具體情況如表2)。這表明宜賓多糧濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)產(chǎn)酯化酶的霉菌呈現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育多樣性的特點。

表140株產(chǎn)酯化酶的霉菌

從表2可以看出，40株產(chǎn)酯化酶霉菌中，以Penicillium屬最多(19株)，Rhizopus和Emericella屬最少，僅各1株。所有產(chǎn)酯化酶的霉菌中，Aspergillus屬分布最為廣泛(曲房、糟醅、窖房和曲藥都檢測到)，Emericella、Rhizopus、Cladosporium、Mucor等4個屬僅分布于窖房空氣中。窖房空氣中檢測到的產(chǎn)酯化酶的34株菌分屬于6個屬，糟醅的4株菌分屬于Penicillium屬和Aspergillus屬，曲房空氣和曲藥中各自僅有的1株產(chǎn)酯化酶菌株都屬于Aspergillus屬。

圖1 釀造環(huán)境產(chǎn)酯化酶霉菌基于ITS nu-rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

表2 產(chǎn)酯化酶的霉菌在各屬的分布情況

從產(chǎn)酶能力來看，D/d＞1.5的10株霉菌中，屬于Penicillium和 Aspergillus各有4株，其余2株分屬于Emericella和Cladosporium。這表明宜賓多糧濃香型白酒生產(chǎn)環(huán)節(jié)中產(chǎn)酯化酶的霉菌以Penicillium和Aspergillus為主。同時，酯化酶能力最強(qiáng)的2株菌J8M-40(D/d=5.00)和 J8M-9(D/d=3.50)都屬于Aspergillus(GenBank登陸號分別為 JN226905.1和JN227032.1)，加之該屬在4個樣點均有分布，這些表明Aspergillus在宜賓多糧濃香型白酒釀造中發(fā)揮著更大的作用。

3 討論

本研究的供試菌株為采用多種分離方法分離自宜賓濃香型白酒窖房、曲藥、曲房、窖泥和糟醅中的霉菌，并通過菌落、菌絲形態(tài)和孢子(盡可能誘導(dǎo)產(chǎn)孢)著生方式去除了冗余。并且，對所有135株霉菌的ITS序列進(jìn)行了相互比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株呈現(xiàn)豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性(結(jié)果另發(fā))。所以這些供試菌株在相當(dāng)程度上代表了宜賓濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中的霉菌群落。而且盡管利用ITS nu-rDNA對真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析也存在低分辨率和種內(nèi)同源基因的問題[11］，但據(jù)目前積累的信息，其足以體現(xiàn)霉菌屬間關(guān)系[11-12］。所以，本研究的結(jié)果在相當(dāng)程度上體現(xiàn)了宜賓多糧濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中產(chǎn)酯化酶霉菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。

由于本研究的主要目的在于在探討多糧濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中產(chǎn)酯化霉菌多樣性，所以僅采用觀測水解圈的方法對菌株產(chǎn)酶能力進(jìn)行初步評價。盡管目前已有較多研究報道[7-8，13］，水解圈大小與產(chǎn)酯酶酶活密切相關(guān)，但微生物的產(chǎn)酶能力是多種因素綜合作用的結(jié)果[14-15］。所以，這些霉菌在濃香型白酒釀造中的作用，有待于深入的探討。同時，本研究中發(fā)現(xiàn)了一些產(chǎn)酯化酶能力較強(qiáng)的菌株(如J8M-40和J8M-9)，這些菌株在白酒和其他行業(yè)有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，白酒生產(chǎn)中微生物主要由大曲提供，但制曲過程中大曲經(jīng)歷一個明顯的升溫過程，霉菌很難耐受超過60℃的高溫，本研究發(fā)現(xiàn)，無論從絕對數(shù)量還是相對數(shù)量來看，大曲內(nèi)部及曲房中可產(chǎn)酯化酶的霉菌均較少，窖房空氣中產(chǎn)酯化酶的霉菌最多，其屬一級分類單位也呈現(xiàn)多樣性的特點。在多糧濃香型白酒的釀造中，糧糟攤涼后加入曲粉混合、入窖這一環(huán)節(jié)是在窖房中開放式完成，窖房空氣中大量的具備產(chǎn)酯化酶的霉菌對多糧濃香型白酒的生產(chǎn)是有利的。而糟醅中檢測到的產(chǎn)酯化酶的霉菌數(shù)量要遠(yuǎn)低于窖房空氣，其主要原因在于在發(fā)酵期間窖內(nèi)處于無氧、高乙醇、有機(jī)酸狀態(tài)[16］，僅有適應(yīng)該環(huán)境的部分霉菌存活，其種屬特別是可產(chǎn)酯化酶的霉菌種屬遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于窖房空氣，而窖房空氣中存在的大量霉菌孢子可在入窖時隨機(jī)接種到糟醅中參與窖內(nèi)發(fā)酵過程，其中包括較多的可產(chǎn)酯化酶的菌株，表明窖房空氣作為窖房微生物在不同輪次發(fā)酵中的暫居地，從一定程度上維持著窖房中產(chǎn)酯化酶的霉菌區(qū)系的相對穩(wěn)定。

本研究檢測到40株產(chǎn)酯化酶霉菌分屬于Penicillium、Aspergillus、Emericella、Rhizopus、Cladosporium、Mucor等6個屬，其中 Penicillium、Aspergillus、Rhizopus、Mucor 具有酯化活性已有報道[5，17］。在本研究中，首次報道了Cladosporium屬的4株可以產(chǎn)生酯化酶的霉菌(分離自窖房，D/d值1.03～2.00)，其在白酒釀造中的功能定位和應(yīng)用價值有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，宜賓多糧濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中存在相當(dāng)數(shù)量具備產(chǎn)酯化酶能力的霉菌，而且這些霉菌顯示出較為豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。但多糧濃香型白酒釀造是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果，窖內(nèi)環(huán)境復(fù)雜且多變，所以這些產(chǎn)酯化酶的霉菌與濃香型白酒品質(zhì)形成的關(guān)系、其在白酒及其他行業(yè)的實際應(yīng)用等都有待于深入研究。

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ABSTRACTThe work herein analysed esterifying enzyme production activity of molds，which were isolated from the fermentation environment.Among the 135 strains，40 strains were identified to produce esterifying enzyme.Most(34 strains)of them came from air of fermentation workshop;then from Zaopei(4 strains);the others were from Quyao(1 strain)and air of Qu workshop(1 strain).The phylogenetic relationships of these 40 strains were analyzed based on the ITS nu-rDNA.Results showed that they were consisted of6genera including Penicillium，Aspergillus，Emericella，Rhizopus，Cladosporium，Mucor，and 19 stains and 13 strains belonged to Penicillium and Aspergillus，respectively.The study not only indicated that a large number of esterifying enzyme production molds existed，but also revealed a high diversity in Yibin strong-flavor liquor fermentation environment.

Key wordsstrong-flavor liquor，molds，ITS nu-rDNA，esterifying enzyme

Diversity of Molds Producing Esterifying Enzyme During Fermentation of Strong-flavor Liquor

Wang Tao1，2，Zhao Dong3，You Lin2，Zhou Yu-ke2，Wang Song1，2，F(xiàn)eng Rui-zhang1，2，F(xiàn)eng Xue-yu2
1(College of Life Science＆ Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China)
2(Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province，Yibin University，Yibin 644000，China)
3(Wuliangye Group Co.，Ltd.，Yibin 644000，China)

碩士，副教授

*四川省科技廳支撐計劃項目(2008NZ0031，2010NZ0091);四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2009JY0149);四川省教育廳重大培育項目(09ZZ039);四川省屬高校白酒生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)計劃資助;宜賓市科技專項研究項目(200805303，2010ZGY016)

2011-11-17，改回日期:2012-03-22