肖嫩群，劉洪娜，張華玲，曾奧，郭抗蕭，陳海強(qiáng)，譚周進(jìn)

1(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙，410208)

2(湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙，410208)

3(湖南省食用菌研究所，湖南長沙，410013)

固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蜜環(huán)菌飲料*

肖嫩群1，劉洪娜2，張華玲2，曾奧2，郭抗蕭2，陳海強(qiáng)3，譚周進(jìn)2

1(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙，410208)

2(湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙，410208)

3(湖南省食用菌研究所，湖南長沙，410013)

以蜜環(huán)菌固態(tài)發(fā)酵物為原料制得一種蜜環(huán)菌飲料。以蜜環(huán)菌固態(tài)發(fā)酵物為原料，提取其中的多糖等營養(yǎng)和藥效成分，進(jìn)行風(fēng)味調(diào)配，通過正交試驗(yàn)和感官評(píng)價(jià)的方法確定蜜環(huán)菌飲料的配方。該發(fā)酵飲料的培養(yǎng)基配方為:白砂糖1.5%，大米80%，黃豆1%，麩皮10%，紅薯7.5%;飲料配方為:蜜環(huán)菌發(fā)酵液添加比例為30%、白砂糖為20 g/L、檸檬酸0.6 g/L、黃原膠0.2 g/L，測(cè)得成品飲料中各成分的含量為:多糖0.049 mg/mL，還原糖0.042 mg/mL，蛋白質(zhì)53.0 mg/mL，氨基酸1.226 mg/mL。飲料的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均達(dá)國家標(biāo)準(zhǔn)。

蜜環(huán)菌飲料，多糖，食藥用菌，固態(tài)發(fā)酵

蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)是一種著名的藥食兼用真菌[1］，菌體中富含多種生理活性物質(zhì)，其所含多糖具有抗輻射、促進(jìn)造血機(jī)能、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制腫瘤生長等藥理和保健功能[2］。蜜環(huán)菌富含多糖﹑粗纖維及多種人體必需的氨基酸，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的食品。國內(nèi)外已有將蜜環(huán)菌開發(fā)成產(chǎn)品的相關(guān)報(bào)道，開發(fā)出腦心舒口服液、健腦露、蜜環(huán)菌浸膏、蜜環(huán)菌片和蜜環(huán)菌糖漿等多種蜜環(huán)菌制劑和產(chǎn)品[3］。

固態(tài)發(fā)酵具有投資少、能耗低等優(yōu)點(diǎn)。本研究以蜜環(huán)菌固態(tài)發(fā)酵物為原料，制作蜜環(huán)菌營養(yǎng)保健飲料，充分利用蜜環(huán)菌發(fā)酵后的有效成分，配制工藝簡單，成本低廉，為保護(hù)和人工開發(fā)真菌資源開辟新的途徑，具有較好的市場(chǎng)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

蜜環(huán)菌(由課題組從天麻中分離保存)、白砂糖、檸檬酸、黃原膠、苯甲酸鈉、苯酚、濃硫酸、乙醇、無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、丙三醇、牛血清白蛋白、磷酸、考馬斯亮藍(lán)-G250、酚酞、甲醛。

1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基:土豆20 g、葡萄糖2 g、KH2PO40.3 g、MgSO40.15 g、瓊脂1.6～1.8 g，水100 mL，pH 6.5;121℃滅菌30 min。

(2)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:采用5種不同培養(yǎng)基配方，首先按量稱取各種配料，拌勻，清水拌濕，悶放約30 min，含水量達(dá)到70%～80%為宜，即手輕捏指縫間有水，滴出2～3滴為度。配方見表1。

表1 培養(yǎng)基配方(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)

1.3 儀器

PL203電子天平，瑞士梅特勒;S.SW-CJ-1BU超凈工作臺(tái)，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;DR9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HH-6恒溫水浴鍋，常州恒德儀器制造有限公司;7012S/7012G組織搗碎機(jī)，北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司;YXQ-SG46-280S高壓蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;722S分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.4 工藝流程

蜜環(huán)菌→活化→固態(tài)發(fā)酵→組織搗碎→熱水浸提→4層紗布過濾→風(fēng)味調(diào)配裝瓶→滅菌→理化及微生物指標(biāo)檢[4］

1.5 操作要點(diǎn)

1.5.1 蜜環(huán)菌菌種活化

蜜環(huán)菌在無菌條件下用接種針挑取菌絲片段接種于斜面，27℃恒溫培養(yǎng)，直至蜜環(huán)菌長滿整個(gè)試管為止。

1.5.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

挑取斜面菌種，無菌操作分別接種到上述5種配方的固態(tài)培養(yǎng)基中，27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄各種培養(yǎng)基中蜜環(huán)菌的生長狀況，包括開始萌發(fā)時(shí)間、生長的快慢及蜜環(huán)菌菌絲量等[5-6］。

1.5.3 組織搗碎及有效成分浸提

首先將固態(tài)發(fā)酵得到的蜜環(huán)菌稱重，按質(zhì)量比1∶5的比例加入水，一起倒入組織勻漿機(jī)中，打碎成漿液。勻漿后的發(fā)酵漿液置于60℃水浴鍋中浸提30 min，以促使菌絲體自溶，有利于較多的營養(yǎng)物質(zhì)溶于其中，然后用4層紗布分離并過濾，得到發(fā)酵勻漿濾液，如果濾液不夠澄清可進(jìn)行二次過濾。

1.5.4 調(diào)配

選取蜜環(huán)菌發(fā)酵液、砂糖、檸檬酸、黃原膠添加量4因素，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，配方設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平表

1.5.5 分裝、殺菌、冷卻

將調(diào)制好的產(chǎn)品分裝到飲料瓶中，置于90℃水浴鍋中滅菌30 min，自然冷卻即為成品。

1.6 產(chǎn)品感官及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7-8］

由10人組成評(píng)定小組，按評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)定，去除最高分和最低分后，計(jì)算出平均分作為該樣品的感官評(píng)分。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):從色澤、氣味、組織形態(tài)3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，總分為100分，其感官質(zhì)量指標(biāo)評(píng)分細(xì)則見表3。

表3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.7 成品飲料的微生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)[9］

1.7.1 菌落總數(shù)的測(cè)定

①梯度稀釋液制備:以無菌操作制備蜜環(huán)菌飲料10倍遞增稀釋液②傾注培養(yǎng):根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)10-1、10-2、10-3三個(gè)稀釋度，取1 mL稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15 mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1 mL稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置(36±1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)(48±2)h，取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1 mL樣品所含菌落總數(shù)。

1.7.2 大腸菌群數(shù)的測(cè)定

具體操作參見GB4789.3-1994《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》。

1.8 成品飲料中各成分含量的測(cè)定

1.8.1 多糖測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[10-11］。首先將離心分離得到的濾液濃縮，加入3倍體積的75%的乙醇溶液沉淀過夜，3000 r/min離心15 min，得到的沉淀用75%的乙醇洗至無還原糖反應(yīng)，再離心得到粗多糖，將離心得到的粗多糖溶于一定量的熱水中，在490 nm的波長處比色測(cè)定吸光度。

1.8.2 還原糖測(cè)定

DNS法。吸取2 mL樣液(可稀釋適當(dāng)倍數(shù))，置于25 mL容量瓶中，再加入3，5-二硝基水楊酸溶液3 mL，沸水顯色5min，然后以流水迅速冷卻，用水定容至25 mL，搖勻，以試劑空白調(diào)零，在540nm處比色求出還原糖的量。

1.8.3 蛋白質(zhì)測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[12］。取1支具塞試管，準(zhǔn)確加入0.1 mL樣品提取液，再加入0.9 mL蒸餾水，5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2 min后，在595 nm波長下比色，記錄吸光度。根據(jù)所測(cè)樣品提取液的吸光度計(jì)算蛋白質(zhì)含量(μg)。

1.8.4 氨基酸測(cè)定

甲醛滴定法。

2 結(jié)果

2.1 蜜環(huán)菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基

蜜環(huán)菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況有較大差異，結(jié)果見表4。可以看出，蜜環(huán)菌在A、B、D三種培養(yǎng)基中均能生長，且B培養(yǎng)基中的蜜環(huán)菌在接種10 d左右后最先開始萌發(fā)，菌索生長的最快，生長狀況最佳，大約45 d左右最先長滿整個(gè)培養(yǎng)基。A、D培養(yǎng)基中的蜜環(huán)菌萌發(fā)的時(shí)間較晚，生長較慢。C中萌發(fā)時(shí)間最晚，且菌絲體幾乎不長，可能是培養(yǎng)基中缺少蜜環(huán)菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而在E培養(yǎng)基中菌絲生長緩慢，且一段時(shí)間整個(gè)培養(yǎng)基開始變黑。由此確定培養(yǎng)基的最佳配方為B(白砂糖1.5%，大米80%，黃豆1%，麩皮10%，紅薯7.5%)。

表4 蜜環(huán)菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況

2.2 飲料配比的確定

為優(yōu)化蜜環(huán)菌飲料的風(fēng)味，本試驗(yàn)按4因素3水平正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別以蜜環(huán)菌發(fā)酵液(A)，糖度(B)，酸度(C)，黃原膠(D)為4個(gè)試驗(yàn)因素，得到9個(gè)配方組合;并以10人的評(píng)審小組，按照感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)調(diào)配樣品進(jìn)行品評(píng)，以感官指標(biāo)總分為指標(biāo)，對(duì)各處理的蜜環(huán)菌飲料的進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定最佳配方。配方的正交試驗(yàn)見表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果表

由正交表5可知，按級(jí)差(R)大小，影響感官指標(biāo)總分的各因素的主次順序分別為A＞D＞B＞C，即發(fā)酵液比例＞黃原膠＞砂糖＞檸檬酸。根據(jù)各水平下K1、K2、K3確定各因素的最優(yōu)水平組合為:A3B3C1D3，即蜜環(huán)菌發(fā)酵液添加比例為30%、白砂糖為20 g/L、檸檬酸0.6 g/L、黃原膠0.2 g/L時(shí)，蜜環(huán)菌飲料酸甜適中，具有較濃郁的菌香味，且香氣純正口感協(xié)調(diào)柔和風(fēng)味較佳。當(dāng)發(fā)酵液的添加量為10%時(shí)，蜜環(huán)菌飲料香味較淡，幾乎聞不到菌香;當(dāng)發(fā)酵液的添加量為20%時(shí)，飲料菌香有所增加，但菌香不夠濃郁;當(dāng)發(fā)酵液的添加量達(dá)到30%時(shí)，飲料有較濃郁的菌香，口感純正無其他異味。白砂糖的添加量為10 g/L時(shí)，飲料口味偏淡。白砂糖添加量20 g/L，檸檬酸的添加量為0.6 g/L時(shí)產(chǎn)品酸甜適中，當(dāng)黃原膠的添加量為0.15 g/L時(shí)，飲料不穩(wěn)定有沉淀產(chǎn)生，黃原膠添加到0.2 g/L時(shí)，飲料較為穩(wěn)定，幾乎無沉淀。

2.3 飲料微生物指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

按照GB/T 4789.3-2003進(jìn)行成品飲料的微生物學(xué)檢測(cè)，結(jié)果表明，飲料中細(xì)菌總數(shù)小于10 CFU/mL，大腸菌群數(shù)不超過3個(gè)/100 mL，致病菌未檢出，表明該飲料符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 飲料中各成分含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，飲料中多糖的含量為0.049 mg/L，還原糖的含量為0.042 mg/L，蛋白質(zhì)的含量為53.0 mg/L，氨基酸的含量為1.226 mg/L。

3 結(jié)論

(1)蜜環(huán)菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:白砂糖1.5%，大米80%，黃豆1%，麩皮10%，紅薯7.5%。

(2)固態(tài)發(fā)酵蜜環(huán)菌所用原料一般為經(jīng)濟(jì)易得、富含營養(yǎng)物質(zhì)的工農(nóng)業(yè)副、廢產(chǎn)品，如麩皮、薯粉、大豆餅粉、高粱、玉米粉等，而且固態(tài)發(fā)酵一般采用開放式，所需設(shè)備簡單，易于操作，具有較廣闊的市場(chǎng)前景[13］。

(3)本試驗(yàn)是采用蜜環(huán)菌固體發(fā)酵物經(jīng)組織搗碎，將發(fā)酵物中菌絲體碎成槳，提取其中多糖等營養(yǎng)和藥效成分而配制飲料，大大提高了飲料的營養(yǎng)及藥理功效。

(4)飲料中含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、多糖等。

[1]徐錦堂.中國藥用真菌學(xué)[M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)合醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997:74-582.

[2]周連玉.黃綠蜜環(huán)菌的研究概述[J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16(3):52-58.

[3]楊淑云，林遠(yuǎn)崇，羿紅，等.珍稀食藥用菌一蜜環(huán)菌的開發(fā)與應(yīng)用[J］.生物學(xué)雜志，2007，24(3):.52-54.

[4]李鳳林.蜜環(huán)菌保健飲料生產(chǎn)工藝的研究[J］.四川食品與發(fā)酵，2008，44(6):59-61.

[5]高婷.亮菌發(fā)酵工藝亮菌多糖及藥效學(xué)研究[D］.成都:四川大學(xué)，2005.

[6]柳煥章，王賀祥，劉慶紅.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)條件初[J］.中國食用菌，2007，26(4):16-19.

[7]呂國紅，張江，李良.葛根植物飲料的研制[J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(8):62-65.

[8]冷桂華，張振東.魚腥草綠茶保健飲料的研制[J］.試驗(yàn)報(bào)告與理論研究，2009，12(5):17-19.

[9]GB/T 4789.21-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)冷凍飲品、飲料檢驗(yàn)》[S］.

[10]劉葳，于源華，毛亞杰.黃綠蜜環(huán)菌多糖的分離純化與組成結(jié)構(gòu)分析[J］.長春理工大學(xué)報(bào)，2007，30(2):102-105.

[11]牛玉秋.鹿鞭商品中總多糖含量測(cè)定[J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15(7):153-155.

[12]林旭輝，代云峰，馮吉莉.苜蓿飲料研制及其有效成分測(cè)定[J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(12):67-70.

[13]袁媛，劉景圣.蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選[J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2009，178(7):57-59.

ABSTRACTStudy on the method using solid fermentation as raw material for health beverage.Armillaria mellea fermentation solid was used as raw material to extract the polysaccharide and other nutritional and medicinal components.After flavor adjustment，the optimum formula of the beverage of armillaria was determined through orthogonal test and sensory evaluation method.The optimizing solid fermentation medium for Armillaria mellea contained sugar 1.5%，rice 80%，soybean 1%，bran 10%，sweet potato 7.5%.The best formula for beverage was as follows:30%armillaria fermented liquid，20 g/L sugar，0.6 g/L citric acid，and 0.2 g/L xanthan gum.The ingredients of the finished product drink were as follows:0.049 mg/mL polysaccharide，0.042 mg/mL reducing sugar，53.0 mg/mL protein，and 1.226 mg/mL amino acid.The senses index，physical and chemical indexes and microbiology indicators of drink have reached national standards.The Armillaria mellea beverage has unique taste and function for health care，it has great value in utilization.

Key wordsArmillaria mellea beverage，polysaccharide，edible fungi，solid fermentation

Studies on Armillaria mellea Beverage Produced by Solid Fermentation

Xiao Nen-qun1，Liu Hong-na2，Zhang Hua-ling2，Zeng Ao2，
Guo Kang-Xiao2，Chen Hai-Qiang3，Tan Zhou-Jin2
1(School of Pharmaceutical Sciences，TCM University of Hunan，Changsha 410208，China)
2(School of Medicine，TCM University of Hunan，Changsha 410208，China)
3(Hunan Domestic Fungus Research Institute，Changsha 410013，China)

碩士，實(shí)驗(yàn)師(譚周進(jìn)教授為通訊作者，E-mail:tanzhjin@sohu.com)。

*長沙市科技局項(xiàng)目(No.k0803270-31);“十一五”國家科技支撐計(jì)劃課題(No.2008BADAIB07);湖南省中醫(yī)藥管理局課題(2010110)

2012-03-01，改回日期:2012-06-03