柯仲成，程小玲

1(黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室，安徽 黃 山，245041)

2(屯溪區(qū)食品安全辦公室，安徽黃山，245000)

枇杷葉總黃酮提取工藝的優(yōu)化*

柯仲成1，程小玲2

1(黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室，安徽 黃 山，245041)

2(屯溪區(qū)食品安全辦公室，安徽黃山，245000)

效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉總黃酮的提取工藝。以乙醇濃度、料液比和提取時間為自變量，總黃酮提取率為因變量，通過自變量與因變量的完全二次響應(yīng)面的回歸擬合，用效應(yīng)面法選取最佳工藝，并進行預(yù)測分析。結(jié)果表明:適宜的提取工藝是，提取液乙醇的體積分數(shù)為73%，料液比1∶11.5(g∶mL)，提取2次，每次140 min。

枇杷葉，效應(yīng)面法，總黃酮，提取

目前從枇杷葉中分離的有效成分主要有黃酮類、揮發(fā)油、三萜酸類、多酚類和有機酸類，其中枇杷葉總黃酮具有明顯的抗氧化、延緩衰老的作用[1-4］。目前主要采用正交設(shè)計對總黃酮的得取工藝進行考察[5-7］，但該法有許多不足之處，故本文采用星點設(shè)計——效應(yīng)面法[8-9］對提取工藝進行優(yōu)化。

1 儀器與材料

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，KQ-100VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，GZX-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，AUY220分析天平(日本島津有限公司)。

枇杷葉(采自黃山歙縣漳潭);蘆丁對照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號:081206)，其他試劑均為分析純;蒸餾水自制。

2 方法

2.1 總黃酮測定

2.1.1 蘆丁對照品的配制

精密稱取5.2 mg蘆丁對照品于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配成104 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.1.2 樣品溶液的配制

取新鮮枇杷葉，烘干，粉碎。稱取枇杷葉粉末約10 g于500 mL具塞錐形瓶中，加250 mL體積分數(shù)80%乙醇，超聲波提取2 h，抽濾，減壓回收，濃縮，加沸水溶解，趁熱過濾，濃縮，減壓干燥，得枇杷葉干浸膏。

精密稱取20 mg枇杷葉干浸膏，用甲醇溶解，過濾，并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容，即得樣品溶液。

2.1.3 波長的選擇

精密量取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇至5 mL，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min;加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加20%NaOH溶液2 mL，再加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min。以試劑為空白參比溶液，用紫外可見分光光度計在400～700 nm波長掃描，發(fā)現(xiàn)在510 nm波長處有最大吸收峰，故最大吸收波長選定為510 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取104 μg/mL的蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至5 mL，分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入20%NaOH溶液2 mL，甲醇定容至刻度，放置15 min。以試劑為空白參比溶液，在510 nm處測定吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得的回歸方程為Y=0.02081+0.01953X，R=0.99935，表明樣品濃度在10.4～52.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 回收率試驗

精密量取樣品液1.00 mL，加入標(biāo)準(zhǔn)蘆丁對照品1.00 mL(20.4 μg/mL)，同2.1.2～2.1.4操作測定吸光度，計算得加樣回收率為102.8%。

2.2 枇杷葉總黃酮超聲提取工藝優(yōu)化

2.2.1 實驗設(shè)計及結(jié)果

預(yù)試驗結(jié)果顯示，枇杷葉回流提取總黃酮的影響因素有:乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)等?？紤]提取次數(shù)是一個非連續(xù)變量因素，處理繁瑣，故根據(jù)實際情況，將其固定為2。根據(jù)星點設(shè)計的原理，每因素設(shè)3水平，用代碼值-1、0、1來表示。代碼值所代表的實際操作物理量見表1，實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 試驗設(shè)計因素與水平的編碼與實際值

表2 星點設(shè)計與結(jié)果表

2.2.2 二項式方程數(shù)學(xué)模型擬合

利用軟件(Design-Expert 7.1.3)將所得的實驗數(shù)據(jù)進行效應(yīng)面分析，以總黃酮提取率(Y)為效應(yīng)值，分別對X1、X2、X3三個因素進行二項式方程擬合和多元線性回歸，發(fā)現(xiàn)用二次階多項式回歸較優(yōu)，回歸方程如下:

刪除其中t檢驗不顯著項，將二項式方程方程簡化為:

從方差分析結(jié)果(見表3)可知，乙醇濃度、液料比、提取時間3個因素對總黃酮提取率都有極顯著影響;液料比和乙醇濃度的相互作用具有顯著影響。因此，該方程較好的描述了總黃酮提取率隨各個因素的變化規(guī)律，具有良好的預(yù)測指導(dǎo)性。

表3 方差分析表

2.2.3 提取工藝優(yōu)化和預(yù)測

利用Design-Expert 7.1.3軟件，參照二次多項式數(shù)學(xué)模型，繪制總黃酮提取率(Y)與相互作用較顯著的2個自變量(X1、X2)的三維效應(yīng)曲面圖及等高曲線，見圖1。利用回歸模型，可以預(yù)測枇杷葉總黃酮提取率的最大值為75.59%，最優(yōu)提取工藝條件為:11.51倍量的73.38%乙醇，提取2次，每次2.33 h。

2.2.4 驗證實驗

根據(jù)預(yù)測的最優(yōu)提取條件，并為了滿足工業(yè)化生產(chǎn)方便，將工藝條件調(diào)整為11.5倍量的73%乙醇，提取2次，每次140 min，進行驗證實驗，3次平行實驗的總黃酮提取率分別為74.55%、76.13%、75.28%，平均值為75.32%，RSD為1.04%。說明所建立的數(shù)學(xué)模型具有精確的預(yù)測性，所選工藝條件具有良好的重現(xiàn)性。

3 討論

天然植物中有效成分的提取工藝研究，采用的較多的是正交設(shè)計試驗。根據(jù)參考文獻[10］的最佳提取工藝(料液比1∶50，提取溫度80℃，提取時間3 h，乙醇濃度50%)，進行了提取預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)總黃酮的平均提取率為71.46%。雖然也可以取得較理想的效果，但由于該方法是采用線性數(shù)學(xué)模型進行擬合分析，因而無法精確找到最佳工藝。本文采用非線性數(shù)學(xué)模星點設(shè)計-效應(yīng)面法進行擬合，可以充分考慮了各影響因素之間的交互作用，提高了預(yù)測指導(dǎo)性和實驗準(zhǔn)確性，將更好的促進枇杷葉總黃酮成分的提取以及在保健食品領(lǐng)域的開發(fā)利用。

圖1 X1X2相互作用對Y的三維效應(yīng)面和二維等高線曲線圖

[1]何英姿.枇杷葉有效成分提取及藥理作用研究進展[J］.廣西工學(xué)院學(xué)報，2007，18(2):81-84.

[2]縱偉，彭雪萍，趙光遠.不同干燥方法對枇杷葉化學(xué)成分和抗氧化活性的影響[J］.食品科技，2006，31(7):128-130.

[3]蔡建秀.枇杷葉、枝條及果實總黃酮含量比較及抗氧化分析[J］.泉州師范學(xué)院學(xué)報，2010，28(7):55-58.

[4]楊桂福.枇杷葉黃酮對油脂的抗氧化性能研究[J］.黑龍江醫(yī)藥，2009，22(2):150-152.

[5]程露.正交試驗法優(yōu)選枇杷葉的提取工藝[J］.江西中醫(yī)藥，2010 ，41(7):70-71.

[6]周振，黎中良.超聲波輔助提取枇杷葉中黃酮類化合物的工藝研究[J］.玉林師范學(xué)院學(xué)報，2008，29(3):60-64.

[7]錢劍林.白沙枇杷葉黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究[J］.食品科學(xué)，2007，28(7):252-254.

[8]吳偉，崔光華.星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法及其在藥學(xué)中的應(yīng)用[J］.國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊，2000，27(5):292-298.

[9]田寶成，賈昌平，楊軍濤，等.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化紅旱蓮總黃酮提取工藝的研究[J］.中成藥，2010，32(3):389-392.

[10]張守梅，許奇志，張立杰，等.乙醇法提取枇杷葉總黃酮的研究[J］.福建果樹，2011(2):6-10

ABSTRACTTo optimize the process of extracting effective constituents from Folium eriobotryae by response surface methodology.The independent variables were ethanol concentration，extracting time and solvents ratio.The dependent variable was extracting rate of total flavonoids.Composite design and response surface methods were used to optimize the extracting process，a two-order polynomial equation was fitted，and model was used to predict the response in the optimal region.the optimum conditions of extraction process were:73%%ethanol，140 minutes for reflux，11.5 fold solvent and2times for extraction.The optimum model is highly predictive.

Key wordsfolium eriobotryae，response surface methodology，total flavonoids，extraction

Study on the Process of Optimization Extraction of Total Flavonoids of Folium Eriobotryae

Ke Zhong-cheng1，Cheng Xiao-ling2
1(College of Chemistry and Chemical Engineering ，Huangshan University，Huangshan 245041，China)
2(Tunxi Office of Food Safety ，Huangshan 245041，China)

碩士，講師。

*黃山學(xué)院科研基金資助項目(2007xkjq012)

2012-03-12，改回日期:2012-06-13