王琳，武俊超，高群玉

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣 州，510640)

豌豆抗性淀粉的酶法制備及其性質研究*

王琳，武俊超，高群玉

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣 州，510640)

以豌豆淀粉為原料，經(jīng)糊化、普魯蘭酶脫支和凝沉處理，使其分子結構發(fā)生改變，制備出高含量的抗性淀粉，并研究了其理化性質。結果表明，在加酶量為300 ASPU/g，脫支時間12 h，凝沉時間24 h時，抗性淀粉含量達到最高52.66%;經(jīng)糊化、脫支和凝沉處理后的樣品結晶結構由C型變?yōu)锽+V型;隨著抗性淀粉含量的增加，其溶解度逐漸降低且均高于原淀粉，但膨脹度均低于原淀粉;消化產(chǎn)物隨抗性淀粉含量的增加而降低。

豌豆淀粉，抗性淀粉，普魯蘭酶，消化性

抗性淀粉(resistant starch，RS)又稱作抗酶解淀粉，是一種不能被人體消化吸收的淀粉。抗性淀粉在小腸中不能被酶解，在結腸中部分可以被腸道菌發(fā)酵而產(chǎn)生短鏈脂肪酸[1］。一般將抗性淀粉分為4類:RS1，物理包埋淀粉;RS2，抗性淀粉顆粒;RS3，回生淀粉;RS4，化學改性淀粉[2］。RS3是淀粉糊化后在冷卻儲藏過程中重結晶形成的抗性淀粉，是抗性淀粉的主要來源。

制備RS3常采用脫支法，常用的脫支法為普魯蘭酶脫支。普魯蘭酶作為淀粉加工過程中一種重要的脫支酶，能切斷普魯蘭、支鏈淀粉和其他相關多聚糖的α-1，6糖苷鍵，產(chǎn)生更多游離的直鏈淀粉分子，經(jīng)過靜置、凝沉，被打亂的直鏈分子重新靠近、纏繞、延伸，形成雙螺旋、折疊，從而形成新型結構[1，3］。Ratnayake等[4］在2001年通過研究不同產(chǎn)地的豌豆淀粉的組成、分子量以及物理化學性質，提出了豌豆淀粉的X-射線衍射圖譜均呈C型晶體結構，但α-淀粉酶的水解敏感性和回生能力因產(chǎn)地不同而有差異，且無法通過凍融穩(wěn)定性手段看出。武俊超等[5］2011年采用交聯(lián)、濕熱、脫支酶解3種不同方法處理豌豆淀粉來比較其抗性淀粉含量及其他性質的變化，實驗表明脫支酶解能使豌豆抗性淀粉含量增加。國外學者對豌豆淀粉性質的研究較多，但對豌豆抗性淀粉的酶解制備及詳細的理化性質分析并沒有深入闡述，國內尚未見對豌豆抗性淀粉的酶法制備及性質研究有相關報道。

課題組采用Megazyme公司的抗性淀粉分析試劑盒，以普魯蘭酶對糊化豌豆淀粉進行脫支、凝沉處理制備抗性淀粉，考察普魯蘭酶添加量、脫支時間、凝沉時間對抗性淀粉形成過程的影響，并詳細研究了制備出的不同抗性淀粉含量的豌豆淀粉的結晶性質、熱力學性質、溶脹度和消化性能，以期為我國豌豆淀粉的深加工及其抗性淀粉研究開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

豌豆淀粉，煙臺東方蛋白有限公司產(chǎn)品;普魯蘭酶(10000ASPU/g)，廣州裕立寶生物科技有限公司產(chǎn)品;抗性淀粉分析試劑盒，愛爾蘭Megazyme公司產(chǎn)品;透析袋，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品;實驗中所使用的其他試劑或藥品均為分析純。

差示掃描量熱儀DSC8000，美國PE鉑金埃爾默公司產(chǎn)品;X射線衍射儀(D/max2000vpc)，日本Rigaka公司產(chǎn)品;漩渦混合器XW-80A，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品;光柵分光光度計722型，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品。

1.2 抗性淀粉含量的測定方法

采用Megazyme公司的抗性淀粉分析試劑盒，根據(jù)AOAC2002.02[6］標準方法測定抗性淀粉含量。

1.3 抗性淀粉樣品制備

1.3.1 普魯蘭酶添加量對抗性淀粉含量的影響

稱取50 g(干基)豌豆淀粉，用pH5.2的0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配成8%的豌豆淀粉乳，于95℃糊化30 min后冷卻至58℃，分別加入0、4、12、24、60、112、144、180、300 ASPU/g(基于淀粉干基重量)的普魯蘭酶進行脫支處理12 h，反應結束后立即升溫至95℃滅酶30 min，終止反應。然后將其冷卻至室溫凝沉12h，用蒸餾水和95%(V/V)的乙醇洗滌至樣品接近中性，置于40℃烘箱中10 h，粉碎、過篩即得樣品，采用AOAC2002.02方法測定其抗性淀粉含量。

1.3.2 普魯蘭酶脫支時間對抗性淀粉含量的影響

將8%的豌豆淀粉乳糊化并冷卻至58℃，添加300 ASPU/g的普魯蘭酶分別進行脫支0、4、12、24、48 h，其他處理條件同1.3.1，測定抗性淀粉含量。

1.3.3 凝沉時間對抗性淀粉含量的影響

將8%的豌豆淀粉乳糊化并冷卻至58℃，添加300 ASPU/g的普魯蘭酶進行脫支12 h，分別于室溫下凝沉0、6、12、24、48 h，其他處理條件同1.3.1，測定抗性淀粉含量。

試樣4在兩次疲勞區(qū)中間主要為鈍化區(qū)(箭頭)，但是觀察發(fā)現(xiàn)，在鈍化區(qū)內出現(xiàn)了少量韌窩(箭頭)，韌窩與鈍化區(qū)交雜在了一起；當受載為23kN時，試樣裂紋尖端鈍化已經(jīng)飽和，并且在試樣幾乎整個截面均出現(xiàn)了少量韌窩，因此可判斷該試樣處于臨界斷裂狀態(tài)，即試樣4為臨界試樣。

1.4 淀粉顆粒熱力學性質

稱取一定量的淀粉樣品于樣品盤中，加入蒸餾水配置成質量濃度為30%淀粉乳，壓緊樣品盤并于室溫放置12 h平衡水分，以10℃/min速率升溫，在30℃保溫1 min，從30℃升溫到150℃。以空白樣品池做參比，測定樣品的熱力學性質。

1.5 溶解度和膨脹度的測定

選擇不同抗性淀粉含量的樣品，配制質量分數(shù)為1%的淀粉乳50 mL，80℃下攪拌加熱30 min，流水冷卻后置于離心管中以4000 r/min離心20 min，將上層清液置于烘箱中蒸干，烘至恒重稱量。計算溶解度S(%)和膨脹度P(g/g)[5，7］:

其中:C為被溶解的淀粉質量，mg;D為沉淀物質量，mg;W為淀粉干基質量，mg。

1.6 X射線衍射

將樣品置于100%濕度條件下平衡水分24 h以消除水分對其結晶度的影響，取一定量平衡好的豌豆抗性淀粉均勻鋪在玻璃片凹槽中置于X射線衍射儀進行測定。測試條件為:起始角4°，終止角35°，步長0.2，掃描速度5°/min，靶型Cu，電壓44 kV，電流26 mA。

1.7 淀粉顆粒消化性[8-9］

用20 mL的pH5.2磷酸鹽緩沖液溶解淀粉樣品160 mg，混合均勻后加入透析袋，并加入10 mL酶活力260 U/mL的α-胰淀粉酶，夾緊透析袋口上下反復翻轉。在燒杯中加入400 mL磷酸鹽緩沖液，將透析袋放入，并置于恒溫振蕩水浴中，在37℃下以100 Hz的頻率振蕩，每隔30 min攪動溶液1次。分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4和5 h時從燒杯中抽取0.5 mL滲析液，按一定比例稀釋。移取2 mL稀釋液到比色管中，加入5%苯酚溶液1 mL和5 mL濃H2SO4。以空白為參比，在490 nm波長下測定吸光度值，并按下式計算整個體系中的水解糖含量:

其中:M為水解糖含量，mg;A為標準曲線中查出的標準麥芽糖量，μg;L為滲析液稀釋倍數(shù);V為每次從體系中抽取的溶液體積，mL;430為在In-vitro模型整個體系的溶液體積，mL;0.001為微克換算成毫克的系數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析處理

2 結果與分析

2.1 普魯蘭酶添加量對抗性淀粉含量的影響

普魯蘭酶提高抗性淀粉含量的原理是普魯蘭酶水解淀粉分子的α-1，6糖苷鍵，切下支鏈淀粉的分支，得到更多的直鏈淀粉[10］。直鏈淀粉數(shù)量增多有利于無定形區(qū)直鏈淀粉分子靠近結合成牢固晶體，同時結晶區(qū)雙螺旋結構使晶體排列更加有序[11］，從而促進抗性淀粉的形成，提高抗性淀粉的含量。普魯蘭酶添加量對豌豆抗性淀粉含量的影響如圖1所示。

圖1 普魯蘭酶添加量對抗性淀粉含量的影響

由圖1可以看出，豌豆抗性淀粉的含量隨著普魯蘭酶添加量的增加而提高。反應初始階段抗性淀粉含量快速提升，當普魯蘭酶添加量為144 ASPU/g時，抗性淀粉含量的增加速度有所減慢，在普魯蘭酶添加量為300 ASPU/g時，抗性淀粉含量達到最大值51.05%。其中當普魯蘭酶添加量大于144 ASPU/g時，隨著酶濃度繼續(xù)增加，抗性淀粉產(chǎn)率有增加但變化很小。其原因可能是，一方面底物的水解度取決于酶的濃度，酶濃度越高，每單位淀粉分子與酶接觸的機會越多，體系所需脫支時間就越短，當酶濃度增加至300 ASPU/g，淀粉分子已充分脫支，即使加酶量繼續(xù)增加，產(chǎn)量基本不發(fā)生變化;另一方面，由于抗性淀粉是由特定聚合度范圍內的直鏈淀粉結合形成[10］，當普魯蘭酶添加量增加，脫支酶雖然更多的切去了淀粉的支鏈，但游離的過短的直鏈淀粉無法形成抗性淀粉，從而使得抗性淀粉的含量增加趨于平緩。綜合考慮添加效果及經(jīng)濟成本，酶濃度為300 ASPU/g時為最佳添加量。

2.2 普魯蘭酶脫支時間對抗性淀粉含量的影響

普魯蘭酶脫支時間對豌豆抗性淀粉含量的影響如圖2所示。

圖2 普魯蘭酶脫支時間對抗性淀粉含量的影響

從圖2可以看出，在酶解脫支反應時間由0 h增加至12 h時，抗性淀粉含量逐漸升高，12 h時抗性淀粉含量達到最大值52.36%。之后繼續(xù)脫支，抗性淀粉含量趨于平緩，無顯著變化，這是由于隨著普魯蘭酶作用時間的繼續(xù)增加，淀粉分子充分脫支，產(chǎn)生大量過短的直鏈淀粉分子，不易形成有序牢固的晶體結構。Shi[12］等也認為合適的鏈長對于結晶和雙螺旋的形成是有利的，過短的鏈分子則會起到抑制作用，不利于抗性淀粉的形成。因此繼續(xù)延長普魯蘭酶脫支時間，抗性淀粉含量基本不發(fā)生變化，所以普魯蘭酶最佳脫支時間為12 h。

2.3 凝沉時間對抗性淀粉含量的影響

凝沉時間對豌豆抗性淀粉含量的影響如圖3所示。由圖3可知，淀粉凝沉時間為0 h時，抗性淀粉含量相對較低，隨著凝沉時間延長，抗性淀粉含量有所增加，在凝沉24 h時含量達到最大為52.66%，之后抗性淀粉的含量隨凝沉時間的延長逐漸降低。凝沉初期，對凝沉淀粉結晶起主要作用的是直鏈淀粉，其凝沉速度快，抗性淀粉含量快速增加。隨后支鏈淀粉也相互締合發(fā)生凝沉，但抗性淀粉含量并不是無限制增加的。一般來說，時間的延長應有利于結晶的形成，從而抗性淀粉的含量提高[13］。但實驗結果表明，當凝沉時間增加至48 h時，抗性淀粉含量降到42.40%?？剐缘矸酆拷档涂赡苡袃蓚€因素:一是凝沉時間過長導致樣品中的酸度發(fā)生改變，偏酸或者偏堿都不利于老化淀粉的形成，也由此衍生出不利的菌種出現(xiàn)[10］;另一方面，當?shù)矸鬯趾康陀?0%時淀粉不易凝沉[14］，長時間的凝沉使樣品的水分含量發(fā)生改變，不利于締合凝沉，同時大量的支鏈淀粉也阻礙了直鏈淀粉的進一步靠近形成晶體。因此，豌豆抗性淀粉的最佳凝沉時間為24 h。

圖3 凝沉時間對抗性淀粉含量的影響

從脫支酶解重結晶處理后的淀粉中選取一組不同抗性淀粉含量的樣品進行性質測定，分別標記為R1(RS=34.51)，R2(RS=38.96)，R3(RS=45.78)，R4(RS=47.38)，R5(RS=52.66)。

2.4 淀粉顆粒熱力學性質

不同豌豆抗性淀粉樣品的熱力學性質參數(shù)如表1所示。

表1 不同樣品的熱力學性質參數(shù)

從表1可以看出，隨著抗性淀粉含量的增加，糊化起始溫度To逐漸變高，說明抗性淀粉含量越高的樣品越難糊化。和原淀粉相比，所有抗性淀粉樣品的糊化起始溫度To、峰值溫度TP、終止溫度TC和糊化焓ΔH均有明顯增加，這是由于脫支酶解后抗性淀粉含量增加，淀粉的顆粒結構中直鏈淀粉部分增加，直鏈淀粉較支鏈淀粉更難以糊化，所以脫支酶解后糊化溫度和糊化焓增加，糊化變得困難[5］。峰值溫度TP和糊化焓ΔH隨著抗性淀粉含量的升高，呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。樣品R3在所有樣品中峰值溫度(103.69℃)和糊化焓(17.55J/g)最高，此時樣品的熱穩(wěn)定性最好。Tc-To反映著淀粉顆粒內結晶體的差異程度，Tc-To越大表明差異程度越大，反之亦然，這與Gao等[15］的研究結果一致。由表1可知，隨著樣品的抗性淀粉含量的增加，Tc-To測定值兩邊低中間高。這說明，經(jīng)過普魯蘭酶脫支處理重結晶后，可能是由于形成部分不完美晶體，使結晶體的差異程度增加，Tc-To增大;但隨著抗性淀粉含量的繼續(xù)增加，形成過多的短直鏈淀粉重排形成的晶體結構緊密有序，大小和完善程度差異變小，故Tc-To反而出現(xiàn)減少趨勢。

2.5 抗性淀粉溶解度和膨脹度

在淀粉加工應用過程中，吸水性是一個重要的性質指標，一般用溶解度和膨脹度衡量淀粉在水中發(fā)生溶脹現(xiàn)象時體積變化的大小。不同抗性淀粉含量樣品的溶解度和膨脹度如圖4和圖5所示。

圖4 不同抗性淀粉含量樣品的溶解度

由圖4可知，經(jīng)普魯蘭酶脫支降解后的抗性淀粉樣品，其溶解度大大高于原淀粉，這是因為脫支作用使得豌豆淀粉的支鏈淀粉被酶解，短直鏈含量增加，致使其溶解度增加。但隨著抗性淀粉含量的升高，溶解度逐漸降低，可能是因為抗性淀粉的雙螺旋結構緊密，持水能力差等特性，含量越高就越難溶于水。由圖5可知，抗性淀粉樣品的膨脹度均低于原淀粉，且隨著抗性淀粉含量的增加，膨脹度逐漸降低。直鏈淀粉含量增加，支鏈淀粉減少是樣品膨脹度降低的主要原因[5］。Kwang Yeon Lee等[16］研究了普魯蘭酶處理大米淀粉后的理化性質，其研究表明，隨著普魯蘭酶添加量的增加其膨脹度逐漸降低，淀粉的膨脹度與支鏈淀粉的結構和直鏈淀粉含量有關。

圖5 不同抗性淀粉含量樣品的膨脹度

2.6 X-射線衍射

豌豆原淀粉和不同抗性淀粉樣品的X射線衍射圖見圖6。

圖6 豌豆原淀粉和樣品的X-射線衍射圖

由圖6可知，豌豆原淀粉在15.1°、17.2°和23.0°處有較強的衍射峰出現(xiàn)，在5.6°、18.0°處有較弱的衍射峰出現(xiàn)，屬于典型的C型結晶結構。普魯蘭酶脫支重結晶處理后，與原淀粉相比，X-射線衍射圖譜顯示出所有抗性淀粉樣品的結晶結構變化在5.6°、14.8°、16.9°、19.3°、22.2°、23.9°處衍射峰強度明顯增大，呈現(xiàn)出更密集和尖銳的峰，轉變?yōu)锽+V型結晶結構[17-18］。結晶結構由C型轉變?yōu)锽+V型，可能是酶解后低溫凝沉易形成B型淀粉，脫支酶解過程中的短直鏈與淀粉本身的脂質形成了直鏈淀粉-脂質復合物，顯示出V型結晶結構。Kwang Yeon Lee等[16］采用普魯蘭酶對大米淀粉進行處理，在較大普魯蘭酶的添加量時，低溫凝沉(40℃)容易形成B型結晶結構，而高溫凝沉(95℃)則更有利于A型結晶結構的形成。

2.7 淀粉顆粒消化性

不同豌豆抗性淀粉樣品的消化產(chǎn)物量如圖7所示。由圖7可見，隨著消化時間延長，所有樣品的消化產(chǎn)物量均增加。隨抗性淀粉含量增加，抗性淀粉樣品的消化產(chǎn)物量不斷降低且均低于原淀粉。在0～3 h內，所有樣品消化產(chǎn)物量明顯升高;3 h時消化產(chǎn)物量趨于穩(wěn)定;此后延長消化時間，消化產(chǎn)物量的增加速度變慢。0～3 h屬于反應前期，此時溶液中α-胰淀粉酶酶濃度最大，且由于α-胰淀粉酶為內切酶，可以無規(guī)則的水解淀粉分子中的α-1，4糖苷鍵，所以α-淀粉酶能與淀粉顆粒充分接觸，消化產(chǎn)物量不斷升高[13］;反應3 h后，淀粉分子被水解成過小的分子鏈，淀粉分子和酶之間的結合位點減少，從而不利于消化的繼續(xù)進行，使得其消化產(chǎn)物的量逐漸趨于平緩。由圖7還可看出隨抗性淀粉含量的增加其消化產(chǎn)物量逐漸降低，這與Pongjanta[19］等的研究成果一致。因此RS含量高的樣品，體外消化性越低，抗酶解力也越強。

圖7 不同豌豆抗性淀粉樣品的消化產(chǎn)物量

3 結論

研究表明，在加酶量為300 ASPU/g，脫支時間12 h，凝沉時間24 h時，產(chǎn)生的抗性淀粉含量最高為52.66%。經(jīng)過糊化、脫支和凝沉的豌豆抗性淀粉樣品的X-射線衍射圖譜，結晶結構由C型轉變?yōu)锽+V型;脫支降解后得到的抗性淀粉樣品，其溶解度逐漸降低但其均高于原淀粉，膨脹度均低于原淀粉;消化產(chǎn)物隨抗性淀粉含量的增加而降低。本課題組使用酶解法制備高含量的豌豆抗性淀粉，為豌豆抗性淀粉的深入研究提供了適宜的實驗條件和理論基礎，在提高豌豆資源的綜合利用率方面具有重要的現(xiàn)實意義。

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ABSTRACTThe pea starches were used as raw materials.With treatments of gelatinization，pullulanase debranching and retrogradation，the structure of pea starches began to change，and the much higher content of resistant starches was produced.Moreover，their physicochemical properties were studied.The results indicated that，after addition of 300ASPU/g of pullulanase，the maximum purity of RS reached 52.66%by debranching for 12 hours and retrogradating for 24 hours.At the same time，crystal structure of the sample changed from C to B+V by gelatinization，debranching and retrogradation.It was also found that the solubilities of samples，which were higher than that of native starch，decreased gradually with the increasing content of resistant starches，while the dilatations of samples were lower than that of native starch.The amount of digestion products decreased with the increasing content of resistant starches.

Key wordspea starch，resistant starch，pullulanase，digestibility

Preparation and Characterization of Pea Resistant Starches with Pullulanase

Wang Lin，Wu Jun-chao，Gao Qun-yu
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

碩士研究生(高群玉教授為通訊作者，E-mail:qygao@scut.edu.cn)。

*廣東省部產(chǎn)學研結合項目(2009B090300274);中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金(10C26216305366)

2012-04-26，改回日期:2012-05-15