范彥博，周才新，張義生，石新華，李赫宇

（1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北武漢430014；2.武漢市中醫(yī)藥研究所國家中管局中藥制劑三級實驗室，湖北武漢430014；3.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

香荷膠囊中香菇總多糖提取工藝

范彥博1，2，周才新1，張義生1，石新華1，李赫宇3

（1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北武漢430014；2.武漢市中醫(yī)藥研究所國家中管局中藥制劑三級實驗室，湖北武漢430014；3.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

研究香荷膠囊中香菇總多糖的最佳提取工藝。采用正交試驗法，考察加水量、提取時間和提取次數(shù)3個因素對提取工藝的影響；采用紫外分光光度法進行測定。香荷膠囊中香菇總多糖的最佳提取工藝為：加入12倍量水，沸水提取3次，每次1 h。優(yōu)選的工藝簡便可行、穩(wěn)定性好。

香荷膠囊；香菇；正交試驗；提取工藝

Abstract:To optimize the extraction process of polysaccharide in Xianghe Capsule.The optimum extraction was investigated by the orthogonal design and UV-spectrophotometry.The optimum extraction conditions：ratio of solid to liquid 12∶1,boiling water extraction for 1h and repeated the extraction for 3 times.This optimized process is simple,stable and efficient.

Key words：xianghe capsule;lentinus edodes;orthogonal design;extraction process

香荷膠囊由香菇、苦丁茶、山楂等藥食同源的中藥飲片組成，具有調(diào)血脂的功效。本文是關(guān)于香荷膠囊中香菇總多糖提取工藝的正交設計實驗。處方中香菇總多糖單獨提取，現(xiàn)代研究表明[1]，香菇總多糖提取物具有良好的治療高脂血證的作用，故確定香菇采用水作為溶劑水浴提取。本文以香菇總多糖的含量為考察指標，采用正交試驗法，優(yōu)選香荷膠囊中香菇的提取工藝，為香荷膠囊的研制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

香菇購自咸寧康進飲片公司。

1.2 儀器

AB-135-S型萬分之一電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SP-756P型紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司；TGL-16B型離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3 試劑

葡聚糖對照品（分子量 5×105）（sigma），無水乙醇、氫氧化鈉、CuSO4·5H2O、檸檬酸鈉、無水硫酸鈉、濃硫酸、苯酚等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 試液的制備

1.乙醇溶液（80%）：20mL水中加入無水乙醇80mL，混勻。

2.氫氧化鈉溶液（100 g/L）：稱取100 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1 L，加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。

3.銅試劑儲備液：稱取 3.0 g CuSO4·5H2O、30.0 g 檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至1 L，混勻，備用。

4.銅試劑溶液：取銅試劑儲備液 50 mL，加水50 mL，混勻后加入固體無水硫酸鈉12.5 g并使其溶解。臨用新配。

5.洗滌劑：取水50 mL，加入10 mL銅試劑溶液、10 mL氫氧化鈉溶液，混勻。

6.硫酸溶液（10%）：取100 mL濃硫酸加入到800 mL左右水中，混勻，冷卻后稀釋至1 L。

7.苯酚溶液（50 g/L）：稱取精制苯酚 5.0 g，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的葡聚糖對照品0.5008 g，加水溶解，定容至50 mL，混勻，再精密移取1 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻。（每1 mL含葡聚糖 0.1002 mg）。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取已干燥的香菇粗粉（40目）20 g，加入10倍量水水浴提取1h，濾過后將提取液定容至1000mL，混勻。準確移取上述提取液5 mL，置于50 mL離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻，沉淀5 min后，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘渣用80%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次~4次。殘渣用水溶解并定容至5mL，混勻。準確移取上述水溶液2mL，置于20 mL離心管中，各加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴煮沸2 min，冷卻，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%硫酸溶液2 mL溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，即得。

2.2 檢測波長的選擇

在300 nm~600 nm波長范圍內(nèi)對對照品溶液進行掃描，結(jié)果對照品溶液在485 nm波長處有最大吸收峰，故選擇測定波長為485 nm。

2.3 線性范圍

精密移取 2.1.2項下對照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置 25 mL 比色管中，準確補充水至2.0 mL，加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，使混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫后用分光光度計，在485 nm波長處，以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度值。以吸光度值（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程為 Y=22.282X-0.0008，相關(guān)系數(shù) r＝0.9996，結(jié)果表明在0.02 mg/mL~0.10 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

精密吸取2.1.2項下對照品溶液1.0 mL，置25 mL比色管中，按2.2項下自“準確補充水至2.0 mL”起操作，在同一條件下分別測定吸光度，重復測定6次，RSD為0.213%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液2.0 mL，置25 mL比色管中，分別在 0、2、4、8、12、24 h 按 2.2 項下自“準確補充水至2.0 mL”起操作，測定吸光度，RSD為1.13%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗

取已干燥的香菇粗粉（40目）6份，每份20 g，精密稱定，照2.1.3項下的方法依法制備，精密吸取各供試品溶液2.0 mL，置5支25 mL比色管中，按2.2項下自“準確補充水至2.0 mL”起操作，在同一條件下分別測定吸光度，RSD為2.82%，表明重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收試驗

取已知含量的香菇粗粉6份，每份5.0 g，精密稱定，分別加入一定量的葡聚糖對照品，照2.1.3項下的方法依法制備，精密吸取各供試品溶液2.0 mL，置6支25 mL比色管中，按2.2項下自“準確補充水至2.0 mL”起操作，依法測定，加樣回收率為99.4%，RSD為0.99%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果Table 1 Results of recovery test

3 香菇總多糖提取工藝的正交設計實驗

為系統(tǒng)考察香菇水提的工藝參數(shù)，選取加水量、提取時間、提取次數(shù)作為考察因素，以總多糖的含量為考察指標，選用L9（34）正交表設計。

3.1 因素水平表的設定

以加水量（A）、提取時間（B）、空白（C）、提取次數(shù)（D）作為考察因素，每個因素設置3個水平，因素、水平見表2。

表2 香菇提取工藝正交試驗因素水平表Table 2 Mushroom extracting technolgy orthogonal experiment factor level table

3.2 方法

3.2.1 供試品提取

稱取已干燥的香菇粗粉（40目）20 g，按正交表中條件水浴提取，濾過后將各提取液定容至1000 mL，混勻。

3.2.2 沉淀粗多糖

準確移取3.2.1項下9份溶液各5 mL，分別置于50 mL離心管中，各加入無水乙醇20 mL，混勻，沉淀5 min后，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘渣用80%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次～4次。殘渣用水溶解并定容至5mL，混勻。

3.2.3 供試品測定液的制備

準確移取3.2.2項下9份溶液各2mL，分別置于20mL離心管中，各加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴煮沸2 min，冷卻，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%硫酸溶液2 mL溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，即得。

3.2.4 供試品測定

準確移取3.2.3項下9份供試品測定液各2.0 mL置于25 mL比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，用紫外分光光度計，在485 nm波長處，以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度值。由標準曲線算出總多糖含量。

3.3 實驗結(jié)果與方差分析結(jié)果

正交試驗設計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 正交試驗設計及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

比較表3中各因素的極差大小，可知各因素對總多糖含量的影響順序為D＞A＞B。由表4方差分析可知：提取次數(shù)與加水量有顯著性差異，說明此因素對總多糖含量影響較大，提取時間無顯著性差異，其對總多糖含量影響較小。綜合以上分析，最佳提取工藝條件為A3B1D3，即：加入12倍量水，提取3次，每次1 h。

3.4 驗證試驗

取已干燥的香菇粗粉3份（20 g/份），按上述最佳提取工藝條件進行驗證試驗，紫外分光光度法測定香菇總多糖的含量，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 Results of verification test

結(jié)果表明：經(jīng)正交試驗優(yōu)選的最佳提取工藝基本穩(wěn)定、可行。

4 討論

1）現(xiàn)代研究表明，香菇水提浸膏和香菇總多糖提取物具有良好的治療高脂血證的作用，另由于多糖溶解于熱水而不溶于乙醇，故本實驗以水作為提取溶劑水浴提取。

2）本文采用正交設計研究香荷膠囊中香菇的提取工藝，試驗結(jié)果表明香菇粗粉加入12倍量水，提取3次，每次1 h，所得香菇總多糖含量較高，且該提取工藝穩(wěn)定，方法簡便、可行，適用于規(guī)?；纳a(chǎn)。

[1]王慧銘,夏道宗,夏明,等.香菇多糖降血脂作用及其機制的研究[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,15(10)：599-602

Extraction Process of Polysaccharide in Xianghe Capsule

FAN Yan-bo1,2,ZHOU Cai-xin1,ZHANG Yi-sheng1,SHI Xin-hua1,LI He-yu3
(1.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430014,Hubei,China;2.3-level Traditional Chinese Medicine Preparation Laboratory of State Administration of TCM of the PRC,Wuhan 430014,Hubei,China;3.Tianjin UBasic Health Biological Technology Limited Company,Tianjin 300457,China）

2012-05-31

范彥博（1982—），男（漢），中藥師，博士，主要從事中藥學研究工作。