陳璐，萬秀娟，尹花，賀揚，林洪

1(中國海洋大學食品安全實驗室，山東青島，266003)

2(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室(籌)，山東青島，266061)

抗氧化啤酒酵母菌株TK-10的選育及工業(yè)生產(chǎn)驗證*

陳璐1，2，萬秀娟2，尹花2，賀揚2，林洪1

1(中國海洋大學食品安全實驗室，山東青島，266003)

2(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室(籌)，山東青島，266061)

以啤酒釀造Lager酵母TS-01為出發(fā)菌株，依次利用含乙硫氨酸、羥基正纈氨酸的平板進行定向育種，利用硝酸鉛平板分離出高產(chǎn)SO2、低產(chǎn)H2S的菌株，然后通過EBC管、100 L中試發(fā)酵試驗，以發(fā)酵液的SO2、H2S、雙乙酰、乙醛、高級醇的含量和發(fā)酵度為篩選指標，得到1株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株TK-10。以出發(fā)菌株TS-01為對照進行600 t大生產(chǎn)對比驗證，表明新菌株TK-10的SO2產(chǎn)量明顯升高，成品酒抗氧化性能得到改善，且口感良好，保持原有風味不變。

Lager酵母，抗氧化，SO2，產(chǎn)物反饋抑制

啤酒在貯藏期間風味都會逐漸發(fā)生變化，或多或少產(chǎn)生一些異味，這些異味被認為來自啤酒的氧化過程，通常稱之為“氧化味”，俗稱“老化味”[1］。老化味的產(chǎn)生是啤酒風味穩(wěn)定性變差的感官表現(xiàn)，也是影響啤酒質(zhì)量和保質(zhì)期的主要因素之一。SO2是一種具有高抗氧化作用的化合物，是提高啤酒內(nèi)源抗氧化力最有效的途徑[2］，其對啤酒新鮮度的貢獻主要體現(xiàn)在兩方面[3］:(1)SO2具有與酶反應(yīng)產(chǎn)物耦合的特性，對氧的親和力非常大，在極短的時間內(nèi)可以將氧祛除從而起到抗氧化劑的作用[4］;(2)SO2可以和不飽和醛類形成加合物以掩飾啤酒的老化味。

冷貯酒中SO2和H2S都是發(fā)酵過程酵母進行甲硫氨酸合成的中間代謝產(chǎn)物[5］，與SO2的抗氧化效應(yīng)不同，H2S具有臭雞蛋氣味，同時也是其他含硫的會導致異味組分的前驅(qū)體，因此在成品酒中的含量控制越低越好。甲硫氨酸生成量的逐漸積累會對SO2產(chǎn)生一種叫做“產(chǎn)量積累反饋抑制”的生物機制，但由于SO2與H2S的代謝生成量具有同向效應(yīng)，僅通過發(fā)酵工藝調(diào)整很難達到既提高SO2產(chǎn)量、又降低H2S產(chǎn)量的目的。目前國內(nèi)外研究者對于高產(chǎn)SO2酵母菌株的選育，主要是通過控制亞硫酸鹽代謝途徑上的幾種基因來完成，如高水平表達MET3和MET14基因[6］，通過硫酸根離子同化途徑來增加SO2的產(chǎn)量;或者是通過破壞MET10基因或MET2基因來增加SO2產(chǎn)量[7-8］。但基因工程菌株目前在實際啤酒生產(chǎn)過程尚無法應(yīng)用，因此此類研究一般僅限于中試水平研究。

為了獲得高產(chǎn)SO2、低產(chǎn)H2S酵母菌株，同時該菌株又能應(yīng)用于啤酒實際生產(chǎn)，本文以生產(chǎn)用Lager酵母菌株TS-01為出發(fā)菌株，先利用甲硫氨酸的結(jié)構(gòu)類似物乙硫氨酸進行第一步定向育種，篩選出能夠解除甲硫氨酸反饋抑制的菌株(具備高產(chǎn)SO2、高產(chǎn)H2S的能力);再利用蘇氨酸的結(jié)構(gòu)類似物羥基正纈氨酸進行二次定向育種，篩選出能夠解除蘇氨酸反饋抑制的菌株(具備高產(chǎn)SO2、低產(chǎn)H2S的能力)，并以發(fā)酵液的SO2、H2S、雙乙酰、乙醛、高級醇的含量和發(fā)酵度為篩選指標，獲得1株發(fā)酵性能優(yōu)良，品評口味與出發(fā)菌株基本相同，而SO2產(chǎn)量提高、H2S產(chǎn)量不變，且抗氧化性能大為提高的優(yōu)良菌株TK-10。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

出發(fā)菌株:生產(chǎn)用Lager酵母菌株TS-01，中國海洋大學食品安全實驗室。

抗性培養(yǎng)基1:0.17%無添加氨基酸及硫氨酸的酵母氮源，0.5%硫酸銨，2%葡萄糖，0.1%硝酸鉛，10 mg/L的DL-乙硫胺酸，2%瓊脂。115℃滅菌20 min。

抗性培養(yǎng)基2:0.17%無添加氨基酸及硫酸銨的酵母氮源，0.5%硫酸銨，2%葡萄糖，100 mg/mL的羥基正纈氨酸，無菌膜過濾。

硝酸鉛培養(yǎng)基:0.5%的酵母粉，0.3%蛋白胨，4%葡萄糖，0.02%硫酸銨，0.1%硝酸鉛，2%的瓊脂，115℃滅菌20 min。

麥汁培養(yǎng)基:13°P麥汁，115℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器

酵母計數(shù)儀，美國BECKMAN COUNTER公司;啤酒全自動分析儀，奧地利ANTON PAAR公司;氣相色譜儀，美國Perkin Elmer公司、美國GE公司;生化培養(yǎng)箱，日本SANYO公司;Lambda 2S分光光度計，PERKIN ELMER公司;e-scan電子自旋共振儀，德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 測定方法

發(fā)酵度測定:啤酒全自動分析儀檢測。

生長速度的測定:采用濁度法，用分光光度計以水為空白600 nm檢測吸光值，以吸光值代表菌株的生長速度。

硝酸鉛平板篩選:H2S與平板中的鉛離子反應(yīng)生成的硫化鉛為黑色，H2S產(chǎn)生的越多，黑色越明顯。因此可以根據(jù)菌落的顏色快速判斷出H2S的產(chǎn)量。

雙乙酰含量的測定:氣相色譜法[9］。

風味物質(zhì)的測定:氣相色譜法[9］。

SO2的測定:鹽酸副玫瑰苯胺法。

H2S 的測定:氣相色譜法[10］。

ESR的測定:電子自旋共振儀[11］。

1.3.2 乙硫氨酸抗性菌株的選育

從保存的斜面上挑取少量酵母，接種到盛有5 mL麥汁培養(yǎng)基的試管里，在25℃條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的酵母培養(yǎng)液涂布在抗性培養(yǎng)基1的平板上，25℃培養(yǎng)，每天觀察酵母生長情況，10天后平板出現(xiàn)暗紅色小菌落。根據(jù)酵母菌落形態(tài)，選取生長較快、邊緣整齊、形態(tài)飽滿的菌落于13°P麥汁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h后，置于4℃冰箱保存。

1.3.3 羥基正纈氨酸抗性菌株的選育

將活化好的菌株，分別接1環(huán)于5 mL麥汁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)72 h，將得到的酵母培養(yǎng)液于3000 r/min離心5 min，除去上清液，加入10 mL無菌水洗滌2遍，重新懸浮于5 mL無菌水中，取100 μL加入到2 mL抗性培養(yǎng)基2中，25℃培養(yǎng)5 d。

1.3.4100 L 中試試驗

100 L發(fā)酵罐中裝13°P麥汁60 L，接入逐級擴大培養(yǎng)的擴培液6 L。9.5℃發(fā)酵，12℃進行雙乙酰還原。

1.3.5 工業(yè)生產(chǎn)驗證

為了進一步考察其工業(yè)應(yīng)用價值，以出發(fā)菌株TS-01為對照，進行600T規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)驗證。9.5℃發(fā)酵，12℃進行雙乙酰還原。每天跟蹤發(fā)酵液中的SO2、H2S、雙乙酰、乙醛、高級醇、高級酯含量及發(fā)酵度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化啤酒酵母菌株的選育

2.1.1 乙硫氨酸抗性菌株的選育

2.1.1.1 初篩

在抗性培養(yǎng)基1的平板上共挑取30支菌株，通過3次重復涂布，選擇生長快、菌落大小一致、且菌落顏色較深的菌株11支進行硝酸鉛平板篩選。從硝酸鉛平板上選擇黑色呈現(xiàn)最明顯的4支菌株A1、A4、A7、A18進行復篩。出發(fā)菌株及初篩菌株(以A1為例)在硝酸鉛平板上的生長情況對比見圖1，通過顏色對比表明初篩菌株的SO2、H2S產(chǎn)量得到提升。

圖1 初篩前后菌株在硝酸鉛平板上的生長對比

2.1.1.2 復篩

將A1、A4、A7、A18四支菌株進行EBC管發(fā)酵試驗(共進行兩輪)，結(jié)果見表1。從表1可見，4株乙硫氨酸抗性菌株的SO2產(chǎn)量均高于出發(fā)菌株，根據(jù)兩輪EBC管發(fā)酵試驗結(jié)果選擇SO2產(chǎn)量較高且穩(wěn)定A1菌株進行下一步試驗。

表1 乙硫氨酸抗性菌株選育的EBC管發(fā)酵試驗

2.1.2 羥基正纈氨酸抗性菌株的選育

將經(jīng)過羥基正纈氨酸抗性培養(yǎng)的A1菌株稀釋、涂布硝酸鉛平板，25℃培養(yǎng)，每天觀察生長情況。從硝酸鉛平板上挑取邊緣整齊、形態(tài)飽滿且顏色較淺的菌落于5 mL麥汁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)36 h后，4℃保存。共計挑取菌株30個，同時將新菌株重新編號為B1-B30。通過生長濁度實驗選擇11支菌株進行硝酸鉛平板涂布及EBC管發(fā)酵試驗，發(fā)酵結(jié)束檢測SO2，數(shù)據(jù)見圖2。

圖2 羥基正纈氨酸抗性選育的EBC管發(fā)酵試驗

由圖2數(shù)據(jù)可以看出，除個別菌株SO2產(chǎn)量比出發(fā)菌株TS-01低之外，大部分菌株SO2產(chǎn)量均有不同程度的提高。選取SO2產(chǎn)量較高且在硝酸鉛平板上菌落生成顏色較淺的菌株B9、B15、B21進行下一步試驗。

2.2100L中試試驗

為進一步篩選性能優(yōu)良的菌株，將B9、B15、B21三支菌株進行100 L中試試驗，試驗結(jié)果見表2。由表2中數(shù)據(jù)可以看出，新選育的3支菌株SO2產(chǎn)量均比出發(fā)菌株高，H2S產(chǎn)量基本持平。菌株B15的SO2產(chǎn)量比出發(fā)菌株TS-01提高180.64%，H2S產(chǎn)量下降28.91%，發(fā)酵度、成熟度與風味指標基本相同，因此選擇B15菌株重新命名為TK-10，進行下一步遺傳穩(wěn)定性驗證。

表2100 L中試冷貯酒結(jié)果

2.3 遺傳穩(wěn)定性驗證

為了驗證抗氧化菌株TK-10的穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳10代，然后分離出單菌落，隨機挑選4個菌株進行BBC管發(fā)酵試驗，測定發(fā)酵液中SO2、H2S、雙乙酰、乙醛、高級醇、高級酯含量及發(fā)酵度指標，取其平均值分別為 8.15 ppm、11.25 ppb、34.25 ppb、6.41 ppm、104.69 ppm、25.73 ppm、65.54%，與第1代菌株 TK-10發(fā)酵各項指標相差不多，即可認定菌株TK-10主要發(fā)酵特性遺傳穩(wěn)定，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 抗氧化菌株TK-10的遺傳穩(wěn)定性分析

2.4 工業(yè)生產(chǎn)驗證

2.4.1 發(fā)酵過程酵母數(shù)的變化

發(fā)酵過程酵母數(shù)的變化如圖3所示?？寡趸闠K-10還原后期酵母細胞數(shù)較出發(fā)菌株TS-01高，但冷貯酒酵母數(shù)與對照相差不大。

2.4.2 發(fā)酵過程降糖變化

發(fā)酵過程中的降糖變化如圖4所示?？寡趸闠K-10與出發(fā)菌株TS-01降糖過程無明顯差異。

2.4.3 冷貯酒SO2及H2S含量

圖3 抗氧化菌株TK-10及其出發(fā)菌株TS-01在600 t大生產(chǎn)發(fā)酵過程中酵母細胞數(shù)的變化

圖4 抗氧化菌株TK-10及其出發(fā)菌株TS-01在600T大生產(chǎn)發(fā)酵過程降糖曲線

冷貯酒中的SO2及H2S含量變化如表4所示?？寡趸闠K-10的冷貯酒SO2含量約為出發(fā)菌株TS-01的2.6倍，而H2S產(chǎn)量卻基本等同，說明在實際大生產(chǎn)規(guī)模下抗氧化菌株TK-10仍能保持其高產(chǎn)SO2、低產(chǎn)H2S的特性。

表4 冷貯酒SO2及H2S含量

2.4.4 成品酒發(fā)酵指標

成品酒的發(fā)酵指標見表5。由表5可見，使用抗氧化菌株TK-10進行發(fā)酵得到的啤酒發(fā)酵度較成品酒略高，成熟度指標比使用原出發(fā)菌株TS-01的要好，這與還原后期TK-10的酵母細胞數(shù)比TS-01高有關(guān)。風味指標兩者之間相差不大。

表5 成品酒成熟度及風味指標

2.4.5 成品酒抗氧化性能

成品酒的抗氧化性能如圖5。由圖5可見，不管是新鮮酒還是強化實驗后，利用抗氧化菌株TK-10進行發(fā)酵得到酒LT值均比原出發(fā)菌株TS-01的要高，說明通過提高酵母菌株SO2產(chǎn)量后其成品酒抗氧化性能確實得到有效提升。

圖5 新鮮酒及強化實驗后的ESR指標

2.4.6 啤酒的感官品評

抗氧化菌株TK-10生產(chǎn)的啤酒經(jīng)國家級啤酒評酒委員品評，認為整體風格與出發(fā)菌株相比保持一致，口感協(xié)調(diào)、爽口。將經(jīng)過35℃7天強化處理的酒進行風味穩(wěn)定性品評，評委一致認為抗氧化菌株TK-10生產(chǎn)的啤酒風味穩(wěn)定性明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，具體品評結(jié)果見表6。

表6 成品酒進行強化試驗后新鮮度品評結(jié)果

風味穩(wěn)定性評分標準如下:分值為1-10分，其中9-10分為新鮮、6-8分為輕微氧化、3-5位中度氧化、1-2分為嚴重氧化。

3 結(jié)論

采用含乙硫氨酸、羥基正纈氨酸的平板進行定向育種，通過EBC管、100L中試發(fā)酵試驗得到1株SO2產(chǎn)量高、H2S產(chǎn)量低，各項發(fā)酵性能良好的菌株TK-10。通過遺傳穩(wěn)定性試驗及600T大生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵驗證，表明其遺傳性能穩(wěn)定，在工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境下仍能保持其高產(chǎn)SO2的能力，SO2產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高2～3倍，成品酒抗氧化性能得到改善，且保持其原有口感及風味不變，在安全有效提高啤酒風味穩(wěn)定性方面具有良好的應(yīng)用前景。

[1]王志沛，高靈燕，王孔云.成品啤酒的風味穩(wěn)定性[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1997，23(1):47-51.

[2]Kaneda H，Kimura T，Kano Y，et al.Role of fermentation conditions on flavor stability of beer[J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1991，72(1):26-30.

[3]Guido L F.How do sulfites help to control beer ageing?[J］.Cerevisia，2005，30(2):132-138.

[4]Dufour J P，Carpentier B，Kulakumba M，et al.Alteration of SO2production during fermentation[J］.Proc EBC Con gr，1989:331-338.

[5]Nordlow H.Formation of sulphur dioxide during beer fermentation[J］.Proc E B C Con gr，1985:291-298.

[6]Korch C，Mountain HA，Gyllang H，et al.A mechanism for sulphite production in beer and how to increase sulphite levels by recombinant genetics[J］.Proc E B C Con gr，1991:201-208.

[7]Hansen J，Kielland-brandt M C.Inactivation of MET2 inbrewer’s yeast increases the level of sulfite in beer[J］.J Biotech，1996，50(1):75-87.

[8]Hansen J，Kielland-brandt M C.Inactivation of MET10 in brewer’s yeast specifically increases SO2formation during beer production [J］.Nat Biotech，1996，14:1587-1591.

[9]王家林，解彬，張偉，等.啤酒風味物質(zhì)氣相色譜分析技術(shù)的研究[J］.啤酒科技，2001(2):17-18.

[10]賀立冬，楊靜靜，劉月琴，等.啤酒中揮發(fā)性含硫化合物的檢測方法及啤酒硫化味品嘗的相關(guān)性研究[J］.啤酒科技，2010(2):43-47.

[11]孫治福，郝俊光，張宇昕，等.Lag-Time、二氧化硫與啤酒新鮮度的關(guān)系[J］.啤酒科技，2009(7):34-38.

ABSTRACTBrewer’s lager yeast strain TS-01(Saccharomyces pastorianus)was selected as parent strain for directed breeding with resistance induction on medium containing ethionine and hydroxynorvaline successively.Mutant stains with high SO2and low H2S production were obtained by screening with medium containing lead nitrate.The mutants were fermented in EBC tube and 100L tank for pilot fermentation respectively using the content of SO2，H2S，diacetyl，aldehyde，higher alcohols and the fermentation degree as the selecting indexes.As a result，TK-10 was obtained as strain with optimal fermentation performance.Industrial fermentation was conducted in 600T tank with the parent strain TS-01 as a control.The results showed that TK-10 was obviously increased in the production of SO2with improved antioxygenic property of beer product.In addition，the beer flavor was maintained with good sensory evaluation.

Key wordsLager yeast，antioxygenic property，SO2，product feed-back inhibition

Screening of Brewer’s Yeast Strain TK-10 with High Antioxygenic Property and Its Industrial Fermentation

Chen Lu1，2，Wan Xiu-juan2，Yin Hua2，Lin Hong1
1(Food Safety Laboratory，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)
2(State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer(in preparation)，Qingdao 266061，China)

博士研究生(林洪教授為通訊作者，E-mail:linhong@ouc.edu.cn)

*國家973項目(2012CB723707)資助

2012-02-10，改回日期:2012-05-24