唐姝姝，唐書澤，李紅愛，吳希陽，陳振強(qiáng)

1(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

2(暨南大學(xué)光電工程系，廣東廣州，510632)

亞甲基藍(lán)對大腸桿菌O157的光動力殺傷作用及機(jī)理*

唐姝姝1，唐書澤1，李紅愛1，吳希陽1，陳振強(qiáng)2

1(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

2(暨南大學(xué)光電工程系，廣東廣州，510632)

探討亞甲基藍(lán)對革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157的光動力殺傷作用及機(jī)理。通過細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù)法研究亞甲基藍(lán)對腸出血性大腸桿菌O157的光動力殺傷作用，同時運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察光動力技術(shù)對O157的基因組DNA的損傷程度和蛋白質(zhì)降解效果。結(jié)果表明，當(dāng)亞甲基藍(lán)的濃度為10 mg/L，可見光(光功密度為200 mW/cm2)光照30 min時，幾乎全部的腸出血性大腸桿菌O157能被殺死，并伴隨有DNA斷裂和蛋白質(zhì)降解。亞甲基藍(lán)對革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157有非常明顯的光滅活效應(yīng)，其滅活機(jī)理可能是對基因組DNA的損傷以及蛋白質(zhì)的降解。

亞甲基藍(lán)，腸出血性大腸桿菌O157，光動力滅菌技術(shù)，脫氧核糖核酸損傷，蛋白質(zhì)降解

傳統(tǒng)的殺菌技術(shù)主要借助熱或化學(xué)的手段來滅菌，這通常會導(dǎo)致食品中不良的物理和化學(xué)變化。抗生素的濫用導(dǎo)致潛在的“超級細(xì)菌”爆發(fā)，迫使人們開始尋求新型、非熱能、生態(tài)友好和經(jīng)濟(jì)有效的殺菌技術(shù)[1］。光動力滅菌技術(shù)(APDT)則是其中的一種。APDT基于光動力作用，利用光敏劑對活性細(xì)菌的優(yōu)先聚集特性，在特定波長的光源照射激發(fā)下，光敏劑吸收光子的能量，產(chǎn)生單態(tài)氧、自由基等活性氧物質(zhì)，這些物質(zhì)能通過氧化作用殺傷靶細(xì)胞，且不傷害周圍組織和細(xì)胞[2］。革蘭氏陰性菌由于具有復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，屏蔽了細(xì)胞膜與單重態(tài)氧的有效結(jié)合，降低了光動力療法的殺傷作用[3-4］。

O157是腸出血性大腸桿菌(Enterohaemorrhagic E.coli，EHEC)的主要血清型，屬于革蘭氏陰性菌，可通過污染的食物、水以及直接接觸感染的人或動物而感染。該菌是近幾年新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的新型人類致病菌，能夠引起人類出血性腹瀉(HC)，溶血性尿毒綜合征(HUS)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，甚至引發(fā)死亡[5］。自1982年在美國首次發(fā)現(xiàn)由腸出血性大腸桿菌O157引起的食物中毒爆發(fā)以來，國內(nèi)外由該菌感染致病的病例數(shù)已呈明顯上升趨勢，引起了人們的廣泛關(guān)注。

亞甲基藍(lán)屬吩噻嗪衍生物，在水溶液中帶有陽性電荷，是第2代光敏劑，其最大吸收波長為600～700 nm，激活后生成的光敏復(fù)合物對病毒包膜和核酸有損傷作用[6］。國外從20世紀(jì)90年代起已開展了基于亞甲基藍(lán)的光滅活血漿中病毒的研究工作，但在微生物方面的應(yīng)用才剛剛起步[7］。本課題選擇腸出血性大腸桿菌O157作為實(shí)驗(yàn)菌株，通過平板菌落計(jì)數(shù)，熒光定量PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，探討亞甲基藍(lán)的光動力殺菌技術(shù)對革蘭氏陰性菌株的滅活效果及作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157，廣州市疾病預(yù)防控制中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器

亞甲基藍(lán)(MB)(10 g/L)，上海紅綠光敏劑研究所有限公司;U21901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;75 W溴鎢燈(光功密度200 mW/cm2)，北京卓立漢光儀器有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.4 引物合成

針對腸出血性大腸桿菌O157的特異基因rfbE設(shè)計(jì)引物，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。其序列如下，上游引物:5＇-CTACAGGTGAAGGTGGAATGG-3＇;下游引物:5＇-TTCCTCTCTTTCCTCTGCGG-3＇。

1.2 腸出血性大腸桿菌O157的光動力滅活試驗(yàn)

1.2.1 細(xì)菌接種及培養(yǎng)

將活化的大腸桿菌的菌懸液以1∶100的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體(4000 r/min，10 min)，棄去上清液，使菌體重新懸浮于0.1 mol/mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并使其OD600=0.5(相當(dāng)于107CFU/mL左右)。

1.2.2 光敏劑梯度稀釋[8］

用PBS稀釋MB，加入菌液，配置MB終濃度分別為0，1，5，10，25，50 mg/L的菌懸液，備用。

1.2.3 光敏劑濃度試驗(yàn)

將不同濃度MB的菌懸液于37℃避光孵育30 min后進(jìn)行光照，即在96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板任取一孔，加入200 μL菌懸液，37℃避光孵育30 min，放在距離溴鎢燈光源20 cm處光照30 min。同時設(shè)置不光照組(L-)進(jìn)行對照。

1.2.4 光照時間試驗(yàn)

將MB濃度為10 mg/L的菌懸液于37℃避光孵育30 min后進(jìn)行光照，即在96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板任取一孔，加入200 μL菌懸液，37℃避光孵育30 min，放在距離溴鎢燈光源20 cm處光照0，5，10，20，30 min。同時設(shè)置不加光敏劑組(S-)進(jìn)行對照。

1.2.5 細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù)

將1.2.3和1.2.4兩組處理所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋后，每個梯度各取100 μL于細(xì)菌平板菌落技術(shù)培養(yǎng)基平皿中，于37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)并繪制失活率柱形圖。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

式中，N為對照組菌落數(shù)平均值;n為實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)平均值。

1.3 腸出血性大腸桿菌O157的基因組DNA損傷試驗(yàn)

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及前處理

按1.2.1的方法培養(yǎng)并收集腸出血性大腸桿菌O157菌液，用PBS稀釋MB后加入收集的菌液，配置MB的終濃度為10 mg/L的菌懸液。在96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板任取5孔，分別加入200 μL菌懸液，37℃避光孵育30 min，放在距離溴鎢燈光源20 cm處光照30 min(S+L+)，同時設(shè)置加光敏劑不光照(S+L-)，不加光敏劑但光照(S-L+)和不加光敏劑且不光照(S-L-)作為對照。

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

取1.3.1中4組處理方法所得的各1 mL菌懸液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行腸出血性大腸桿菌O157的基因組DNA提取，提取出的DNA作為實(shí)時熒光定量PCR檢測腸出血性大腸桿菌O157的特異性基因rfbE的模板。

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增

確定最佳反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件，用制備的模板進(jìn)行SYBR Green-I熒光定量PCR試驗(yàn)。該反應(yīng)的總體系為25 μL，其中，2×SYBR Green Premix Ex Taq母液12.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL(20 μmol/L)，滅菌去離子水9.5 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性5 s，57℃退火15 s，共擴(kuò)增40個循環(huán)。

1.4 腸出血性大腸桿菌O157的蛋白質(zhì)降解試驗(yàn)

1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)及前處理

參照1.3.1的方法。

1.4.2 SDS-GAGE分析菌體全蛋白降解試驗(yàn)

將1.4.1中4種處理方法所得的各1 mL菌懸液，置于1.5 mL EP管中，離心(10000 r/min，2 min)后棄上清液，向菌體中加入20 μL無菌去離子水使菌體懸浮。加入5 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液，于95℃下加熱5 min后進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性差異用t檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MB濃度對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

各濃度MB對腸出血性大腸桿菌O157的光動力滅活作用見圖1和圖2。在MB濃度低至1 mg/L時，光照30 min能使約91%的腸出血性大腸桿菌O157滅活;當(dāng)MB濃度達(dá)到50 mg/L的時候，幾乎可以使全部的腸出血性大腸桿菌O157滅活。表明在光照條件下，隨著MB濃度的增加，光動力對O157的殺傷作用逐漸增強(qiáng)。而光敏劑對照組和光照對照組均沒有非常明顯的殺傷效果。

2.2 光照時間對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

在MB濃度相同的情況下不同光照時間對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響見圖3和圖4。當(dāng)MB濃度固定在10 mg/L時，光照5 min以上即可使絕大部分的腸出血性大腸桿菌O157失活;當(dāng)光照時間達(dá)到30 min時，可以使腸出血性大腸桿菌O157的失活率達(dá)到99.9999%。這表明在MB的濃度一定時，隨著光照時間的延長，光動力殺菌技術(shù)對腸出血性大腸桿菌O157的殺傷作用逐漸增強(qiáng)。

圖1 不同濃度MB對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)(CFU)的影響

圖2 不同濃度MB對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

圖3 不同光照時間對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)(CFU)的影響

2.3 MB-APDT對腸出血性大腸桿菌O157基因組DNA的損傷效果分析

圖4 不同光照時間對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

針對腸出血性大腸桿菌O157的特異基因rfbE設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR試驗(yàn)，結(jié)果見圖5和圖6。實(shí)驗(yàn)組的DNA模板的量相對于對照組確實(shí)有很大程度的減少。之后進(jìn)行了溶解曲線分析，樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度是在81℃左右，在其他溫度下并沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(見圖6)，證明了產(chǎn)物的專一性。這表明在一定濃度的光敏劑和適當(dāng)?shù)墓庹諘r間下能夠引起腸出血性大腸桿菌O157的基因組斷裂，且損傷程度較大。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)模板的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖6 標(biāo)準(zhǔn)模板的熔融曲線

2.4 MB-APDT對腸出血性大腸桿菌全蛋白降解效果的影響

MB-APDT對腸出血性大腸桿菌O157的全蛋白降解效果見圖7。腸出血性大腸桿菌O157在加光敏劑MB(10 mg/L)且進(jìn)行光照30 min的情況下，其菌體的大部分蛋白質(zhì)被降解，只在30、32和65 ku這3處有不完全降解的較淺條帶出現(xiàn)。而光敏劑對照組、光照對照組及完全對照組則沒有變化。

圖7 MB-APDT處理后細(xì)菌全蛋白降解效果的SDS-PAGE圖譜

帶陰離子和電中性的光敏劑對革蘭氏陰性菌的殺傷作用小，而帶陽離子的光敏劑對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有明顯的殺傷作用[9］。本課題組前期的研究工作已經(jīng)證實(shí)，光動力殺菌技術(shù)對曲霉孢子[10］、革蘭氏陰性菌金黃色葡萄球菌[11］及單核細(xì)胞增多性李斯特菌[12］具有良好的滅菌效果，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了MB在光照條件下對革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157也有很強(qiáng)的殺傷作用。但帶陽離子光敏劑對細(xì)菌有明顯殺傷作用的機(jī)理目前尚不清楚，Minnock等人認(rèn)為可能是帶陽離子的光敏劑與細(xì)菌細(xì)胞的某種亞結(jié)構(gòu)選擇性地結(jié)合，使得細(xì)菌對其更為敏感[13］。North等認(rèn)為可能是帶陽離子的光敏劑與細(xì)胞膜所帶的負(fù)電荷容易產(chǎn)生靜電吸引力，使得光敏劑能夠穿透細(xì)菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜有效結(jié)合，通過改變細(xì)胞膜的滲透性從而殺死細(xì)菌[14］。

3 結(jié)論

加入濃度為10 mg/L的MB，在光功密度為200 mW/cm2的溴鎢燈下光照30 min即能使腸出血性大腸桿菌O157的失活率達(dá)到99.9999%，并伴有基因組DNA損傷和蛋白質(zhì)降解。亞甲基藍(lán)介導(dǎo)的光動力技術(shù)可能通過DNA損傷和蛋白質(zhì)降解來實(shí)現(xiàn)對革蘭氏陰性菌的殺傷作用。因此，光動力殺菌技術(shù)也有可能被開發(fā)成一種有效的殺滅革蘭氏陰性菌的技術(shù)應(yīng)用于肉類食品安全領(lǐng)域。

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ABSTRACTThe mechanisms of anti-microbial photodynamic technology(APDT)against Gram-negative bacteria Escherichia coli O157 by methylene blue(MB)was investigated.The bactericidal effect of MB-APDT on E.coli O157 was measured by counting the reduction of colony forming unit(CFU).The damage of DNA was observed by real-time polymerase chain reaction(RT-PCR)and the degradation of proteins was investigated by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE).Results showed that almost all of the E.coli O157 were photo inactivated by illumination with 30 min visible light(power density 200 mW/cm2)in the presence of 10 mg/L MB.The significant photo-inactivation of Gram-negative bacteria Escherichia coli O157 may be due to the damage of DNAs and the degradation of proteins.

Key wordsmethylene blue，Escherichia coli O157，anti-microbial photodynamic technology，DNA damage，protein degradation

Mechanisms of Anti-microbial Photodynamic Technology Against Escherichia coli O157 by Methylene Blue

Tang Shu-shu，Tang Shu-ze，Li Hong-ai，Wu Xi-yang，Chen Zhen-qiang
1(Department of Food Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China)
2(Department of Optoelectronic Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

碩士研究生(唐書澤教授為通訊作者)。

*暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金項(xiàng)目

2012-03-14，改回日期:2012-05-22