張學(xué)況，杜麗平，王超，杜雨軒，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)

酶解法增溶酵母(1→3)-β-D-葡聚糖的研究*

張學(xué)況，杜麗平，王超，杜雨軒，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)

以實(shí)驗(yàn)室制備的酵母(1→3)-β-D-葡聚糖為原料，通過酶解法制備水溶性酵母(1→3)-β-D-葡聚糖，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和生物活性進(jìn)行了研究。以水溶性酵母葡聚糖得率為指標(biāo)，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定了酵母(1→3)-β-D-葡聚糖酶解的工藝條件。優(yōu)化后的酶解條件為:酶活濃度0.15 U/mL，底物質(zhì)量濃度0.5 g/100 mL，酶解溫度40℃，pH3.5，酶解時(shí)間0.5 h，該酶解條件下水溶性酵母葡聚糖得率為80.3%。紅外光譜分析表明，水溶性葡聚糖仍具有(1→3)-β-D-葡聚糖分子構(gòu)型，剛果紅實(shí)驗(yàn)表明其具有三螺旋結(jié)構(gòu)。活性實(shí)驗(yàn)表明，水溶性葡聚糖能有效提高E.coli誘導(dǎo)的患腹膜炎小鼠的存活率。

葡聚糖，酶解法，正交實(shí)驗(yàn)，紅外光譜，生物活性

酵母(1→3)-β-D-葡聚糖是一種堿不溶性葡聚糖，具有多種免疫刺激活性，能夠通過刺激免疫系統(tǒng)對(duì)生物反應(yīng)進(jìn)行修飾，保護(hù)機(jī)體免受異物的感染，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，有抗感染、抗腫瘤、抗輻射和促進(jìn)傷口愈合等功能，是一種重要的生物效應(yīng)應(yīng)答劑(biological response modifiers，BRM)[1-4］。因此，酵母葡聚糖在食品、飼料、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。由于其不溶于水，在應(yīng)用上受到了很大限制，針對(duì)這一問題國內(nèi)外學(xué)者已嘗試采用物理、化學(xué)和生物修飾的方法對(duì)其進(jìn)行改性增溶。目前國內(nèi)外對(duì)多糖的物理修飾主要是超聲解聚，化學(xué)修飾主要有氨基化、羧甲基化、磷酸化和硫酸化[5-9］等方法，生物方法主要是通過酶解作用降低多糖的分子量，提高其在水相中的溶解度。Kery[10］等人采用黑曲霉生產(chǎn)的葡聚糖酶對(duì)酵母葡聚糖進(jìn)行水解，但得率不高。本試驗(yàn)以諾維信提供的專一性(1→3)-β-D-葡聚糖酶對(duì)酵母(1→3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行水解，考察了酶活濃度、反應(yīng)溫度、時(shí)間、底物質(zhì)量濃度和pH對(duì)葡聚糖酶解反應(yīng)的影響，并對(duì)水溶性酵母葡聚糖產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)、活性進(jìn)行了研究，為拓寬酵母葡聚糖的應(yīng)用范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母細(xì)胞壁，安琪酵母有限公司;大腸桿菌(E-.coli)，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心;昆明鼠(20 g)，天津奧易責(zé)任有限公司;(1→3)-β-D-葡聚糖酶，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;海帶多糖，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

LD5-10低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限責(zé)任公司;ALPHA1-4D真空冷凍干燥機(jī)，MARTIN CHRIST;UV—2401PC可見紫外分光光度計(jì)，日本島津;Bruker VECTOR 22傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母葡聚糖的制備

稱取酵母細(xì)胞壁50 g，加入3 g/100 mL NaOH溶液300 mL，75℃恒溫水浴3 h，離心收集沉淀。沉淀中加入3 g/100 mL NaOH溶液200 mL，100℃恒溫水浴2 h，離心收集沉淀，沉淀加蒸餾水洗滌，無水乙醇洗滌脫水，離心收集沉淀，40℃干燥，即得到不溶性酵母葡聚糖。

1.3.2 酶活力的測定

稱取海帶多糖10 mg，分散到9 mL的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH5.0)中，50℃水浴10 min。加入1 mL(1→3)-β-D-葡聚糖酶液，50℃恒溫水浴反應(yīng)30 min。取出后沸水浴5 min終止反應(yīng)，用DNS法[11］測其還原糖質(zhì)量。酶活力單位的定義:在上述條件下，每分鐘能生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.3(1→3)-β-D-葡聚糖的酶解

稱取0.2 g不溶性酵母葡聚糖分散于9 mL的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，恒溫水浴一定時(shí)間后加入1 mL(1→3)-β-D-葡聚糖酶溶液進(jìn)行反應(yīng)。試驗(yàn)初始條件為:酶活濃度0.1 U/mL，底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL，水浴溫度50℃，緩沖液pH4.0，酶解時(shí)間2 h。反應(yīng)結(jié)束后沸水浴終止反應(yīng)，離心(104r/min)取上清液，測定還原糖和總糖?；蛏锨逡航?jīng)濃縮、真空冷凍干燥，制得可溶性酵母葡聚糖樣品。

1.3.4 三螺旋結(jié)構(gòu)的測定[12］

配制624 μmol/L的剛果紅溶液，不同濃度(0.0025～0.500 mol/L)的NaOH溶液和1 mg/mL的糖液。分別取2 mL不同濃度的NaOH溶液于比色管中，滴加1 mL濃度為1 mg/mL的糖液，28℃作用30 min，然后分別加入濃度為624 μmol/L的剛果紅溶液1 mL，28℃作用30 min。UV-2401PC可見紫外分光光度計(jì)400～600 nm進(jìn)行掃描，并記錄其最大吸收波長。

1.3.5 紅外光譜分析

樣品與KBr按質(zhì)量比1∶150混合，壓片，紅外掃描，分辨率:4 cm-1，掃描次數(shù):16。

1.3.6 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)[13］

20只昆明鼠隨機(jī)分成2組，每組10只。兩組小鼠分別腹腔注射濃度為4 mg/mL的可溶性酵母(1→3)-β-D-葡聚糖溶液和葡萄糖溶液1 mL，24 h后再分別給2組小鼠腹腔注射1 mL濃度為109CFU/mL大腸桿菌(E.coli)懸浮液，觀察并記錄各組小鼠的死亡情況。

1.3.7 酶解液中還原糖質(zhì)量的測定

DNS法[11］。

1.3.8 酶解液中總糖質(zhì)量的測定

硫酸-蒽酮法[14］。

1.3.9 水溶性葡聚糖得率的計(jì)算

酶解反應(yīng)結(jié)束后，酶解液經(jīng)滅酶活、離心后，取上清液測定還原糖和總糖質(zhì)量，計(jì)算可溶性多糖得率:

式中:m總為酶解液中總糖質(zhì)量，g;m還為酶解液中還原糖質(zhì)量，g;m0為添加酵母葡聚糖的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素各水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，其中每個(gè)水平設(shè)3個(gè)平行，處理時(shí)取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。圖1(a)表明還原糖、總糖和可溶性酵母葡聚糖的得率都隨著底物質(zhì)量濃度的增加而減小。這是由于葡聚糖具有強(qiáng)吸水性和持水性，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)體系粘度不斷增大，阻礙了酶與底物的接觸。由圖1(b)可以看出，不同底物質(zhì)量濃度下溶液中可溶性多糖的濃度(由于底物質(zhì)量不同，酶解葡聚糖的得率和質(zhì)量濃度的變化趨勢不同)，在底物質(zhì)量濃度低于0.5 g/100 mL時(shí)，雖然可溶性多糖的得率高，但在溶液中濃度很低，不利于后期提取。因此綜合考慮，底物質(zhì)量濃度應(yīng)大于0.5 g/100 mL。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)水平表

由圖1(c)可以看出，可溶性葡聚糖得率隨著酶活濃度的增大先增大后減小，當(dāng)酶活濃度為0.1 U/mL時(shí)，得率最大可達(dá)41.8%。當(dāng)酶活濃度大于0.1 U/mL時(shí)，隨著酶活濃度的增大，酶開始作用于已經(jīng)酶解的葡聚糖，產(chǎn)生大量的二糖、單糖等，導(dǎo)致總糖得率增大的同時(shí)還原糖得率也迅速增大，可溶性多糖得率隨之降低。

由圖1(d)可知，葡聚糖酶的最適溫度為45℃，此時(shí)總糖、還原糖和可溶性葡聚糖得率均達(dá)到最大?？扇苄云暇厶堑淖畲蟮寐蕿?1.9%。

由圖1(e)可以看出，總糖和還原糖的得率均隨pH升高先增大后減小，酶的最適pH為5.0，此時(shí)總糖和還原糖得率均達(dá)到最大值，但可溶性葡聚糖得率較低，因此pH5.0不是制備可溶性葡聚糖的最佳pH?？扇苄云暇厶堑寐孰SpH的升高在40%上下波動(dòng)，pH4.0時(shí)得率最大為48.7%。在pH4.0～pH5.5時(shí)，總糖得率達(dá)到最大、趨于平衡，而還原糖得率呈先增后減的趨勢。因此，可溶性葡聚糖得率總體呈波動(dòng)的變化趨勢。

由圖1(f)可知，可溶性葡聚糖得率隨酶解時(shí)間的增加先增大后減小，在酶解0.5 h時(shí)，其得率最大為51.7%。當(dāng)酶解0.5 h后，隨酶解時(shí)間的增加，葡聚糖酶可以充分的作用于經(jīng)酶解的葡聚糖片段，導(dǎo)致還原糖增加趨勢大于總糖增加趨勢，因此可溶性葡聚糖得率呈下降趨勢。

圖1 各因素對(duì)可溶性酵母葡聚糖得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

為了使酶解反應(yīng)條件達(dá)到最佳，獲得最大的可溶性多糖得率，在上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L16(45)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表2，結(jié)果及極差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

由表3極差分析可知，各因素對(duì)酶解葡聚糖得率的影響主次順序?yàn)?酶解溫度＞底物質(zhì)量濃度＞pH＞酶活濃度＞反應(yīng)時(shí)間。最佳工藝條件是A3B1C2D1E1，即酶活濃度為0.15 U/mL，底物質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL，反應(yīng)溫度40℃，pH3.5，反應(yīng)時(shí)間為0.5 h。在此條件下制備水溶性酵母葡聚糖得率為80.3%，質(zhì)量濃度為3.6 mg/mL。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

2.3 酶解葡聚糖三螺旋結(jié)構(gòu)分析

本實(shí)驗(yàn)以剛果紅為空白對(duì)照，以剛果紅-Dextran T-500為無規(guī)則卷曲對(duì)照，以剛果紅-海帶多糖為有序的三螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)照，研究了NaOH濃度對(duì)剛果紅-酶解多糖最大吸收波長的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 多糖-剛果紅絡(luò)合物最大吸收波長隨NaOH濃度的變化曲線

由圖2可以看出，NaOH濃度在0.0025～0.25 mol/L時(shí)，剛果紅-海帶多糖與剛果紅-酶解葡聚糖的最大吸收波長維持在495 nm以上。當(dāng)NaOH濃度大于0.25 mol/L時(shí)，剛果紅-海帶多糖與剛果紅-酶解葡聚糖的最大吸收波長迅速向短波方向移動(dòng)。而剛果紅與剛果紅-Dextran T-500的最大吸收波長隨NaOH濃度的增大而減小。這表明酶解葡聚糖同海帶多糖一樣具有三螺旋結(jié)構(gòu)，NaOH濃度大于0.25 mol/L后，隨著NaOH濃度增加多糖分子間的氫鍵遭到破壞，使有序的三螺旋結(jié)構(gòu)解旋，導(dǎo)致最大吸收波長向短波方向移動(dòng)。

2.4 酶解葡聚糖紅外圖譜

由圖3可看出，經(jīng)酶解制備的水溶性酵母葡聚糖與酶解前的酵母葡聚糖紅外光譜圖基本一致，在890 cm-1處有明顯的β-糖苷鍵的吸收峰，在2923 cm-1和1370 cm-1處的特征吸收峰表明多糖由β-1，3-D-糖苷鍵連接，說明其分子構(gòu)象沒有發(fā)生變化。

圖3 酶解前后酵母葡聚糖的紅外光譜圖

2.5 酶解葡聚糖對(duì)腹膜炎小鼠存活率的影響

由圖4可知，注射水溶性酵母葡聚糖的小鼠7 h時(shí)開始死亡，10 h時(shí)存活率為80%，之后不再死亡，在隨后兩周的觀察中并未發(fā)現(xiàn)存活小鼠有任何反常的癥狀。而注射葡萄糖的小鼠5 h時(shí)開始死亡，10 h時(shí)全部死亡。這說明腹腔注射水溶性酵母(1→3)-β-D-葡聚糖可以刺激小鼠免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)其抵抗E.coli誘導(dǎo)的患腹膜炎的感染，提高小鼠存活時(shí)間和存活率，為可溶性酵母葡聚糖應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)提供依據(jù)。

圖4 酶解葡聚糖對(duì)患腹膜炎小鼠存活率的影響

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定(1→3)-β-D-葡聚糖酶對(duì)酵母(1→3)-β-D-葡聚糖的最佳酶解條件為:酶活濃度為0.15 U/mL，底物質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL，反應(yīng)溫度40℃，pH3.5，反應(yīng)時(shí)間為0.5 h。在此條件下水溶性酵母葡聚糖得率為80.3%，在酶解液中的質(zhì)量濃度為3.6 mg/mL。并通過剛果紅實(shí)驗(yàn)證明了酶解葡聚糖具有三螺旋結(jié)構(gòu)，通過紅外光譜證明了其仍具有β-1，3-D-葡聚糖分子構(gòu)型。腹腔注射酶解酵母(1→3)-β-D-葡聚糖能有效刺激小鼠免疫系統(tǒng)，提高E.coli誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠存活率。

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ABSTRACTThe process of preparation water-soluble yeast(1→3)-β-D-glucan with enzymolysis was studied in this paper.Single-factor test and orthogonal test were conducted to study the influences of various factors on the yield of soluble polysaccharide.The optimal reaction conditions:enzyme concentration 0.15 U/mL，substrate concentration 0.5 g/100mL，reaction temperature 40℃，pH 3.5 and reaction time 0.5 h.The yield of soluble polysaccharide by these conditions is 80.3%.In order to determine the triple helix structure and the molecular configuration of the samples，Congo Red test and FT-IR spectra were used.The soluble polysaccharide by enzymolysis can stimulate the immune system of mice.Not only can it extend the survival time of the mice which was challenged by E.coli，but also can enhance the survival of it.

Key wordsglucan，enzymolysis，orthogonal test，F(xiàn)T-IR spectra，biological activity

An Enzymolysis Method for the Solubilization of Yeast(1→3)-β-D-glucan

Zhang Xue-kuang，Du Li-ping*，Wang Chao，Du Yu-xuan，Xiao Dong-guang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology Ministry of Education，Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory，College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China)

碩士研究生(杜麗平教授為通訊作者，E-mail:dlp123@tust.edu.cn)。

*天津科技大學(xué)科學(xué)研究基金項(xiàng)目(20100208)

2011-11-07