祁丹丹，楊瑞金，華霄，沈蓮蓮，張文斌，趙偉

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú) 錫，214122)

天山凍土中產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)*

祁丹丹1，楊瑞金2，華霄2，沈蓮蓮1，張文斌2，趙偉2

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú) 錫，214122)

借助形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定及16S rDNA序列分析，對(duì)從新疆天山凍土中篩選得到的產(chǎn)低溫蛋白酶菌株進(jìn)行鑒定，確定其為Pseudomonas sp.(假單胞菌屬)N-8。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K+0.4，pH 7.0。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該菌產(chǎn)生的低溫蛋白酶最適作用pH為7.0，在pH 7.0～8.0呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性;最適作用溫度為25℃，在25、35、45℃下均呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性;金屬離子Cu2+、K+、Ca2+、Mn2+對(duì)酶活有一定的抑制作用，其中Cu2+抑制作用明顯，F(xiàn)e2+、Mg2+、Na+、Zn2+對(duì)酶活力有不同程度的激活作用。

耐冷菌，低溫蛋白酶，酶學(xué)性質(zhì)，假單胞菌屬

天山凍土屬于我國(guó)高海拔高山常年凍土，凍土環(huán)境中微生物會(huì)產(chǎn)生一系列適應(yīng)低溫、寡營(yíng)養(yǎng)、強(qiáng)輻射、凍融等極端因子的分子機(jī)制，為低溫微生物生理多樣性提供了可能[1］。低溫酶由于在低溫環(huán)境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應(yīng)溫度和縮短反應(yīng)時(shí)間，從而大幅度節(jié)約能源[2］，因而在食品加工、日化產(chǎn)品、皮革加工等需要低溫催化的行業(yè)中具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[3］。目前發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)低溫蛋白酶的菌有假單胞菌屬(Psedomonas)[4］、黃桿菌屬(Flavobacterium)[5］、氣單孢菌屬(Aeromonas)[6］、希瓦氏菌屬(Shewanella)[7］、弧菌屬(Vibrio)[8］。這些低溫菌在永久性低溫環(huán)境下經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化適應(yīng)，已有著適應(yīng)低溫環(huán)境的特殊結(jié)構(gòu)與生理生化機(jī)制。它們所產(chǎn)生的低溫蛋白酶也有著獨(dú)特的生理生化特征與結(jié)構(gòu)特征。有關(guān)低溫微生物的資源勘探與代謝活性產(chǎn)物研究，已成為國(guó)際微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[9］，我國(guó)的一些研究機(jī)構(gòu)也積極開(kāi)展低溫蛋白酶生產(chǎn)菌株的篩選工作[10-11］。

本課題組從新疆凍土中篩選出1株產(chǎn)低溫蛋白酶的耐冷菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以提高其產(chǎn)酶能力，并對(duì)其所產(chǎn)低溫蛋白酶的粗酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為極地微生物產(chǎn)低溫蛋白酶的研究打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品采自新疆天山冰川海拔3845 m處。沿2 m深的凍土剖面每隔20 cm取樣，迅速將其裝入已滅菌的保鮮盒內(nèi)，置于車載冰箱保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，在超凈臺(tái)上削去表皮可能受到污染的樣品，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

PYG富集培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨0.5，酵母粉1，葡萄糖1，CaCl20.02，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.04，NaCl 0.5，pH 7.2;

初篩培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨0.05，酵母膏0.03，酪蛋白1，瓊脂1.5，pH 7.0;

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1，酵母粉0.4，酪蛋白1，MgSO4·7H2O 0.02，K2HPO4·3H2O 0.1，pH 7.0。

1.3 產(chǎn)低溫蛋白酶菌種的篩選

初篩:吸取富集后的培養(yǎng)液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15℃培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)好后，挑選透明圈較大菌株，斜面保存。

溫度復(fù)篩:以40℃為上限生長(zhǎng)溫度[12］，即在該溫度不生長(zhǎng)的菌株為耐冷菌。將初篩得到的產(chǎn)蛋白酶菌株在初篩平板上點(diǎn)樣，在40℃不生長(zhǎng)的菌株，為試驗(yàn)菌株。

蛋白酶活力的測(cè)定:按照SB/T10317—1999規(guī)定的福林(Folin)試劑顯色法測(cè)定酶活，進(jìn)一步篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。底物2%的酪蛋白，pH 7.2磷酸鹽緩沖液，15℃反應(yīng)10 min，660 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算酶活力。在上述條件下，1 mL酶液每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活單位(U)。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)

將所得菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在電鏡下觀察菌株形態(tài)，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)[13］及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14］進(jìn)行生理生化鑒定。

1.4.216S rDNA PCR擴(kuò)增和序列分析

擴(kuò)增引物為通用引物，

上游引物(F):5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

下游引物(R):5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反應(yīng)過(guò)程:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72℃補(bǔ)齊10 min。用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳(1.0%瓊脂糖凝膠)，回收目的片段，純化產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coli DH5α，LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上挑選白斑，抽提質(zhì)粒，PCR鑒定陽(yáng)性重組菌，送上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

利用CLUSTAL X將所測(cè)序列與Genbank中核酸序列進(jìn)行比對(duì)，選用MEGA 5.0軟件Kimura 2-parameter距離模型進(jìn)行neighbour-joining分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行分析。

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

連續(xù)培養(yǎng)72 h，每隔6 h取1次樣，測(cè)菌體生長(zhǎng)量(OD600nm)，同時(shí)制備粗酶液，測(cè)定酶活。

1.5.2 發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

分別在10、15、20、25、30、35℃下進(jìn)行搖瓶，考察不同發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。

1.5.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)酶的影響

選取葡萄糖、酵母粉、酪蛋白、K+4個(gè)因子，采用4因素3水平正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，考察培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.5.4 發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

選取種齡、起始pH、接種量、裝液量4個(gè)因子，采用正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，考察不同發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.6 粗酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.6.1 粗酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

最適溫度測(cè)定:將酶活力測(cè)定中的反應(yīng)溫度分別控制在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65℃，其他條件不變，分別測(cè)定酶活。

熱穩(wěn)定性測(cè)定:將粗酶液分別置于25、35、45、55℃，保溫15、30、45、60 min，冷卻后測(cè)酶活。

1.6.2 粗酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

最適作用pH測(cè)定:配置不同pH的緩沖液，并用相應(yīng)緩沖液配置2%酪蛋白溶液作底物，測(cè)定酶活。

pH穩(wěn)定性測(cè)定:將用不同pH緩沖液處理的酶液分別放置在25℃下保溫1 h后測(cè)酶活。其中pH 5.0～7.0用磷酸鹽緩沖液，pH 8.0～9.0用Tris-HCl緩沖液，pH 10.0～11.0用硼砂-氫氧化鈉緩沖液。

1.6.3 金屬離子對(duì)酶活的影響

不同金屬離子Fe2+、Mn2+、K+、Na+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+水溶液與等體積蛋白酶混合，使最終離子濃度為5 mmol/L，25℃反應(yīng)15 min，測(cè)酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選

從天山凍土中通過(guò)酪蛋白平板法篩選到66株具有蛋白酶活性菌株，經(jīng)溫度復(fù)篩及Folin法測(cè)定酶活，篩選得到5株產(chǎn)蛋白酶活力較高的耐冷菌株，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，菌株N-8所產(chǎn)蛋白酶酶活最高，選取該菌做進(jìn)一步研究。

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選結(jié)果

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)

該菌為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細(xì)胞單個(gè)，大小為(0.5～0.8)μm×(2.0～3.2)μm，有莢膜，有鞭毛(見(jiàn)圖1);在酪蛋白平板上，菌落直徑3～4 mm，呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產(chǎn)生明顯的透明圈。

2.2.2 生理生化特性

由表2生理生化特性可以發(fā)現(xiàn)，該菌株接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽(還原)反應(yīng)為陽(yáng)性，能水解明膠，硫化氫試驗(yàn)、伏-普二氏試驗(yàn)(VP)、甲基紅試驗(yàn)(MR)為陰性，不能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、鼠李糖、棉子糖。

圖1 N-8菌株透射電鏡照片(5000×8)

表2 分離菌株的生理生化特性

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，該菌株16S rDNA片段長(zhǎng)約1500 bp，將其16S rDNA序列同NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的相似序列進(jìn)行同源性比較，如圖2所示。Blast分析顯示該菌與Pseudomonas extremaustralis 14-3在同一分支，二者序列相似性為99%。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rDNA序列以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果，可以將分離菌株歸為Pseudomonas屬，命名為Pseudomonas sp.N-8。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

圖3顯示了培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，雖然菌體生長(zhǎng)旺盛，但酶活很低。隨著穩(wěn)定期到來(lái)，酶活迅速升高。該菌在48 h酶活最高，隨著生長(zhǎng)速度減慢，酶活也逐漸降低。從細(xì)菌生長(zhǎng)曲線分析，酶的積累主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，說(shuō)明對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期菌體不再大量繁殖，主要產(chǎn)生蛋白酶。因此酶的收獲應(yīng)控制在細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

圖2 菌株P(guān)seudomonas sp.N-8及相關(guān)細(xì)菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

圖4 顯示培養(yǎng)溫度對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響。菌株在20℃菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況較好，溫度高于或低于此溫度菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力有明顯下降的趨勢(shì)。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

2.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)酶的影響

極差分析結(jié)果表明(表3)，各因素對(duì)產(chǎn)酶的影響大小順序?yàn)?酪蛋白＞酵母粉＞葡萄糖＞K+;最佳培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K+0.4;按最佳組合測(cè)定發(fā)酵液酶活為47.34 U/mL。

2.3.4 發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

極差分析結(jié)果表明(表4)，各因素對(duì)產(chǎn)酶的影響大小順序?yàn)?種齡＞起始pH＞接種量＞裝液量;最佳培養(yǎng)條件為:種齡24 h，起始pH 7，接種量4%，裝液量50 mL/250 mL。按最佳組合測(cè)定發(fā)酵液酶活為49.56 U/mL。

表3 培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4 粗酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 粗酶的最適溫度

溫度對(duì)Pseudomonas sp.N-8產(chǎn)低溫蛋白酶活力的影響結(jié)果如圖5所示。該酶在10℃時(shí)可保持約60%的相對(duì)酶活，隨著溫度的升高，酶活逐漸提高，在25℃酶活最高，高于此溫度酶活開(kāi)始下降。在溫度20～30℃范圍內(nèi)，低溫蛋白酶都能保持較高的酶活，溫度超過(guò)40℃，酶活急劇下降，65℃時(shí)酶活不足最高酶活的10%。因此，N-8所產(chǎn)蛋白酶的最適溫度為25℃。

2.4.2 熱穩(wěn)定性

圖5 酶的最適溫度

菌株N-8所產(chǎn)低溫蛋白酶熱穩(wěn)定性如圖6所示。該酶在25℃呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性，保溫60 min仍可保持95%的酶活;在35、45℃保溫45 min酶活喪失了20%左右;在55℃下保溫30 min后酶活喪失了75%。這與報(bào)道的低溫蛋白酶熱穩(wěn)定性相符，即在較高溫度下(＞50℃)酶可快速失活[2，3］。

圖6 酶的熱穩(wěn)定性

2.4.3 粗酶的最適pH

pH對(duì)Pseudomonas sp.N-8產(chǎn)低溫蛋白酶活性的影響結(jié)果如圖7所示。菌株N-8所產(chǎn)低溫蛋白酶最適pH為7.0，在pH 7.0～7.5范圍內(nèi)保持較高酶活。在酸性或堿性環(huán)境中，酶活大幅度下降。故菌株N-8所產(chǎn)低溫蛋白酶為中性蛋白酶。

圖7 酶的最適pH值

2.4.4 pH的穩(wěn)定性

菌株N-8所產(chǎn)低溫蛋白酶pH穩(wěn)定性如圖8所示。菌株N-8所產(chǎn)低溫蛋白酶pH在7.0～8.0范圍內(nèi)相對(duì)酶活達(dá)到90%以上，在pH 5.0時(shí)酶活下降約40%，在pH 10.0時(shí)酶活下降約25%。說(shuō)明菌株N-8所產(chǎn)低溫蛋白酶在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。

圖8 酶的pH穩(wěn)定性

2.4.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

金屬離子對(duì)Pseudomonas sp.N-8產(chǎn)低溫蛋白酶活性的影響結(jié)果如圖9所示。K+、Cu2+、Ca2+、Mn2+對(duì)蛋白酶有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用明顯;Fe2+、Mg2+、Na+、Zn2+對(duì)蛋白酶有不同程度的激活作用。

圖9 金屬離子對(duì)酶活的影響

3 結(jié)語(yǔ)

低溫蛋白酶主要由生存在低溫冷凍環(huán)境中的微生物產(chǎn)生，目前大多數(shù)產(chǎn)酶菌株是從南、北極和常年恒定在低溫的極端環(huán)境中分離而得。本課題從新疆天山長(zhǎng)年冷凍的土壤中分離獲得1株產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株，經(jīng)鑒定為Psedomonas屬，并對(duì)其生長(zhǎng)、產(chǎn)酶條件和粗酶性質(zhì)做了初步研究。報(bào)道低溫蛋白酶的最適酶活溫度大部分為15～40℃，如史勁松等報(bào)道耐冷菌株SYP-A2-3所產(chǎn)低溫蛋白酶的最適酶活溫度為15℃[15］，徐國(guó)英等報(bào)道Pseudoalterom onas sp.QI-1(假交替單胞菌屬)所產(chǎn)蛋白酶的最適酶活溫度為40℃[16］。本研究分離菌株產(chǎn)低溫蛋白酶的最適溫度為20℃，酶活最適作用溫度為25℃，55℃保持30 min酶活喪失75%，65℃下作用酶活僅保留不到10%。本文篩選的菌株為今后低溫酶的嗜冷機(jī)制研究及其在食品、洗滌劑、化妝品、皮革等工業(yè)上的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

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ABSTRACTAstrain producing the cold-adapted protease has been isolated from the frozen soil of the Tianshan Mountains，China.Based on the morphological，physiological，biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis，the strain was identified as Pseudomonas sp.N-8.Fermentation conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments.The optimal medium components were determined as follows:10 g/L glucose，8 g/L yeast powder，20 g/L casein，0.4 g/L KH2PO4，pH 7.0.The research on the properties of crude enzyme showed that the optimal pH and temperature for activity were 7.0 and 25℃，respectively.As to the thermal stability of the cold-adapted protease，it was stable over the range of 25～45℃.The test of pH stability indicated that the cold-adapted protease was more stable within pH 7.0～8.0.The protease activity was inhibited by Cu2+，K+，Ca2+，and Mn2+，but it was stimulated by Fe2+，Mg2+，Na+，and Zn2+.

Key wordspsychrotrophs，cold-adapted protease，enzymatic properties，Psedomonas

Screening，Identification of Pseudomonas sp.N-8 producing Cold-adapted Protease and the Study on Enzymatic Properties

Qi Dan-dan1，Yang Rui-jin2，Hua Xiao2，Shen Lian-lian1，Zhang Wen-bin2，Zhao Wei2
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(楊瑞金教授為通訊作者)。

*江蘇省自然科學(xué)基金“疏水納米微環(huán)境中β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)機(jī)制的研究”(編號(hào)BK2011149)，以乳糖異構(gòu)化為目標(biāo)的葡萄糖異構(gòu)酶定向改造研究中高通量篩選模型的建立(其他)

2012-03-20，改回日期:2012-04-27