劉歡，李艷，嚴明，陳圣，郝寧，許琳

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，210009)

重組釀酒酵母全細胞催化合成萊鮑迪苷A*

劉歡，李艷，嚴明，陳圣，郝寧，許琳

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，210009)

用經密碼子優(yōu)化后合成的甜葉菊UDP糖基轉移酶UGT76G1編碼基因構建了表達該酶的重組釀酒酵母YPH499(pYES2-UGT)。建立了通過檸檬酸鈉調節(jié)釀酒酵母細胞內由葡萄糖到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的代謝通量，用于催化甜菊苷合成萊鮑迪苷A的全細胞催化方法。優(yōu)化后的催化體系為:甜菊苷1 g/L，葡萄糖20 g/L，普郎尼克F6810 g/L，MgCl26 g/L，檸檬酸鈉15 g/L，pH 7.2，細胞密度200 g濕細胞/L反應液，在37℃下經72 h后轉化生成萊鮑迪苷A 267.89 mg/L。

甜葉菊，萊鮑迪苷A，糖基轉移酶，UGT76G1，全細胞催化

萊鮑迪苷A(rebaudioside A，RA苷)是一種無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜昧劑，其甜度是蔗糖的150～300倍，熱值僅為蔗糖的1/300[1］，而且口味純正，沒有后苦味。RA苷是從甜菊葉中提取出來的甜菊糖中的一種糖苷成分。目前，已從甜菊糖中至少發(fā)現(xiàn)了8種糖苷[2］，其中最主要的3種糖苷成分在甜葉菊葉片中的含量通常為:甜菊苷(ST苷)9.1%，RA苷3.8%，萊鮑迪苷C 0.6%[3］。市售甜菊糖一般以ST苷為主要成分，雖然ST苷甜度約為蔗糖的200倍，但其略帶甘苦的后味影響了甜菊糖的口感。因此，提高RA苷相對含量有助于改善甜菊糖味質。

UDP-糖基轉移酶UGT76G1能特異性地催化ST苷通過一步糖基化反應合成RA苷[4］。然而，甜葉菊中天然UGT76G1含量甚微，分離純化成本高，難以獲取大量的酶蛋白，并且，糖基轉移反應中需要昂貴的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作為糖基供體，必然導致RA苷酶促合成應用的經濟性差。全細胞催化利用微生物細胞提供的酶系作為催化劑，細胞內多種酶系的存在可以實現(xiàn)酶的級聯(lián)反應，從而彌補了酶法催化中級聯(lián)催化過程不易實現(xiàn)的不足，其方法制備簡單，在生物催化領域中具有不容忽視的優(yōu)勢。本文即構建重組表達UGT76G1的釀酒酵母菌，初步研究RA苷的全細胞催化合成。為了避免添加UDPG作為輔底物，本研究在反應體系中加入糖酵解途徑的抑制劑檸檬酸，主要通過調控6-磷酸果糖激酶的活性，提高向糖原合成等途徑的UDPG通量，將相對廉價的葡萄糖在重組酵母細胞內合成UDPG以滿足UGT76G1所催化的轉糖基反應的需要。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

基因和引物分別由南京金思瑞和上海美吉公司合成;限制性內切酶購于NEB公司;T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶和DNA Marker購自Takara公司，質粒DNA抽提試劑盒、DNA片段純化與膠回收試劑盒購于上海申能博彩有限公司;標準品ST苷和RA苷購自曲阜海根甜菊制品有限公司。

1.2 菌株和質粒

大腸桿菌菌株E.coli DH5α和釀酒酵母菌株S.cerevisiae YPH499為本實驗室保藏，pMDTM18-T載體購自TaKaRa公司，質粒pYES2為本實驗室保藏，pYES2-UGT是本實驗構建的帶UGT76G1糖基轉移酶基因的重組質粒。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌完全培養(yǎng)基液體LB:蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。完全培養(yǎng)基液體YPD:10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。選擇培養(yǎng)基液體SC-U(SC基本培養(yǎng)基[9］缺乏尿嘧啶)，其中碳源為20 g/L葡萄糖。SCGal-U即將SC-U培養(yǎng)基中葡萄糖用半乳糖代替。

1.4 基因的優(yōu)化合成與重組菌的構建

檢索NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫，根據(jù)AY345974基因序列，使用OptimumGeneTM軟件對此基因進行合成前的優(yōu)化設計。在不改變氨基酸序列的前提下，用釀酒酵母偏好的密碼子替代原基因中的稀有密碼子，將優(yōu)化后的基因命名為UGT?；蚝铣捎山鹚继毓就瓿?。

根據(jù)合成的UGT基因序列信息，用primer5.0軟件設計構建表達載體所用的引物并加設酶切位點，設計的上下游引物分別為:

P1:5’-CGGAATTCAAACAATGTCTGAAAATAAGACTGAAACTACTG-3＇，

P2:5’-CCGCTCGAGTTATAATGATGAAATATAAGAAACCAA-3＇。

引物由上海美吉公司合成。PCR反應條件為:94℃變性5 min;按如下參數(shù)循環(huán)30次:94℃變性30S，60℃退火30 s，72℃ 延伸2 min，循環(huán)30次;最后72℃延伸10 min。

將PCR擴增的基因片斷通過“TA”克隆的方式連接到克隆載體pMDTM18-T上，構建克隆質粒pMDTM18-T-UGT并測序。然后用EcoR I和Xho I雙酶切測序結果正確的pMDTM18-T-UGT和表達質粒pYES2，純化后將兩者連接構建重組質粒pYES2-UGT，將重組質粒熱擊轉化入E.coli DH5α得到重組菌DH5α(pYES2-UGT)，提取質粒進行PCR以及用BamH I進行單酶切鑒定，最后將鑒定結果正確的重組質粒pYES2-UGT轉入釀酒酵母YPH499感受態(tài)中，得到的重組YPH499(pYES2-UGT)菌體懸液涂布于SC-U篩選平板上，于30℃培養(yǎng)，直至長出單菌落。

1.5 重組酶誘導表達

重組菌YPH499(pYES2-UGT)在液體YPD中，30℃培養(yǎng)活化。然后按2%接種量轉接新鮮液體SC-U中，30℃，培養(yǎng)48 h，使菌體生物量積累。室溫6000 r/min離心10 min，獲得菌體用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7)懸浮洗滌后，離心收獲菌體，轉移至SCGal-U培養(yǎng)基中進行誘導，30℃，12 h。誘導后室溫離心，所得菌體即可用于破碎后測酶活或者全細胞催化實驗。

1.6 酶活性測定

將離心收集的重組釀酒酵母細胞，用磷酸鉀緩沖液洗滌兩次，加入Yeast Buster蛋白抽提試劑進行處理，破碎細胞。然后于4℃，12000 r/min離心5 min，收集酶粗提液備用。

在1.5 mL的反應體系中(1.2 mol/L ST苷、4 mol/L UDPG、3 mol/L MgCl2、10 μg/mL BSA、pH=7.2)[10］，加入適量酶粗提液反應，30℃室溫12 h后，高溫加熱5 min終止反應。以不加酶液的反應液做空白對照。12000 r/min離心1 min后上清液用高效液相色譜(HPLC)進行分析，色譜條件為:色譜柱Lichrospher NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為V(乙睛)∶V(水)=80∶20;流速1 mL/min;柱溫;40℃;檢測波長:210 nm。

在完成抹面施工后要進行水泥混凝土路面的表面橫向紋理處理和路面壓槽施工。壓槽施工中要做到對混凝土表面干濕度的有效把握，例如可采用現(xiàn)場用手試摁的方式進行檢查。同時要在兩側模板位置上放置一根槽鋼，保證槽鋼位置平面朝下，凹面則要朝上，這是為壓紋機提供合理的過往軌道空間[3]。

酶活力單位定義為:在上述反應條件下，30℃，1 min催化形成1 μmol RA苷所需要的酶量為1個活力單位(U)。

1.7 全細胞催化體系的初步建立以及優(yōu)化

取1.5小節(jié)中所得2 g濕細胞，轉移至小三角瓶中，10 mL反應體系中加入下述物質:底物ST苷1 g/L，UDPG2g/L，通透劑1%，MgCl24 g/L，磷酸鉀緩沖液0.1 mol/L，pH=7.0，30℃，反應72 h后離心，上清液用HPLC分析。在此體系基礎上先考察了通透劑的影響，并通過加入代謝調節(jié)物質檸檬酸鈉，用20 g/L的葡萄糖成功地替代UDPG作為輔底物，至此，全細胞催化體系初步建立。在此基礎上，對檸檬酸鈉濃度、MgCl2濃度、pH、溫度這4個因素分別進行了優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 基因的優(yōu)化合成與重組菌的構建

以優(yōu)化后合成的UGT基因為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增，擴增的產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結果由圖2(a)可知，PCR產物為單一條帶，對應片斷大小約在1.3～1.4 kb之間，與預期結果相符合(目的產物大小是1348 bp)。重組載體構建的過程如圖1所示。

圖1 重組質粒pYES2-UGT構建示意圖

重組質粒pYES2-UGT轉化入E.coli DH5α得到的重組菌DH5α(pYES2-UGT)，提取質粒，以此為模板，用P1和P2引物進行PCR鑒定，用BamHⅠ進行單酶切鑒定，其結果分別見圖2(b)和2(c)，與預期相符，預期的2個片段大小分別為:6668 bp，536 bp。將鑒定后的重組質粒導入YPH499挑陽性克隆，即為重組菌YPH499(pYES2-UGT)。

2.2 重組酶的活性測定

活化后的重組菌按2%接種量轉接新鮮SC-U中，30℃，培養(yǎng)48 h，使菌體生物量積累。室溫洗菌，集菌，菌體移至SCGal-U培養(yǎng)基中誘導，30℃，12 h。誘導后菌體，加入YeastBuster蛋白抽提試劑處理，破碎細胞，離心所得酶粗提液進行酶活測定。在1.5 mL的反應體系中(1.2 mmol/L ST苷、4 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2、10 μg/mL BSA、pH=7.2)，重組菌YPH499(pYES2-UGT)的酶活性為7.1 U/mg濕菌體。液相結果如圖3所示，1.2 mmol/L ST苷最終轉化生成0.63 mmol/L RA苷，轉化率達到55%。

圖2 UGT的基因擴增與重組質粒pYES2-UGT的鑒定

圖3 粗酶液催化ST苷生成RA苷的HPLC圖譜

2.3 全細胞催化體系的初步建立

2.3.1 通透劑對全細胞催化的影響

底物只有進入細胞后才能在胞內酶的催化下進行有效的轉化，因此，細胞膜通透性成為全細胞催化反應所需考慮的首要問題。在添加UDPG條件下考察了吐溫80、TritonX100濃度為1%(v/v)，CTAB、普郎尼克F68為1%(g/L)等幾種物質對細胞膜通透性的影響。將誘導表達后的重組菌體離心，按1.7小節(jié)所述進行全細胞催化反應，結果如圖4所示。

可以看出，未添加任何通透劑時，幾乎檢測不到RA苷的量;而加入通透劑后，ST苷與UDPG能夠進入細胞，在重組菌誘導產生的UGT76G1糖基轉移酶的催化下，將ST苷轉化為甜度更高的RA苷。其中，作為一種新型的高分子非離子表面活性劑，普郎尼克F68在此轉化體系中表現(xiàn)出較佳的通透性。

2.3.2 以葡萄糖作為輔底物建立全細胞催化體系

圖4 通透劑對全細胞催化的影響

圖5 全細胞催化體系的建立

從圖5可以看出，加入1%(g/L)普郎尼克F68條件下，直接添加葡萄糖時，RA苷無明顯合成;但是當在添加葡萄糖的同時加入檸檬酸鈉時，轉化生成的RA苷量較明顯，可達到32 mg/L。這種有效的轉化結果可能是由于檸檬酸是糖酵解途徑中6-磷酸果糖激酶的有效抑制劑，即在一定程度上抑制了糖酵解途徑，促使6-磷酸葡萄糖轉化成1-磷酸葡萄糖，進而提高了UDPG的合成量。

2.4 全細胞催化體系的條件優(yōu)化

2.4.1 檸檬酸鈉濃度的影響。

考察了不同檸檬酸鈉濃度對全細胞催化合成RA苷的影響，結果如圖6所示。其它反應條件:MgCl24 g/L，pH7.0，30℃。

圖6 不同檸檬酸鈉濃度對全細胞催化的影響

檸檬酸鈉濃度1～15 g/L時，RA苷的生成量逐漸增加;在15 g/L時，RA苷量達到最高;當濃度在15～25 g/L時，RA苷量呈現(xiàn)明顯下降趨勢。這說明添加適量濃度的檸檬酸鈉，對調節(jié)酵母代謝途徑從而促進UDPG生成起到較大作用，而過高濃度的檸檬酸鈉可能對糖酵解途徑抑制較大，從而使酵母基本代謝受到影響。

2.4.2 pH的影響

考察了不同pH的緩沖液對全細胞催化合成RA苷的影響，結果如圖7所示。反應條件:檸檬酸鈉15 g/L，MgCl24 g/L，30℃。

圖7 不同催化反應pH對全細胞催化的影響

pH≤7.0時，RA苷生成量較低，這可能是由于在酸性緩沖液中UGT7G1酶的活性較低所致，因為在對該酶的性質進行研究時，我們發(fā)現(xiàn)該酶在pH＜7.0時，酶活性很低;當pH為7.2～7.5時，RA苷的量較高;pH為7.8時，RA苷量驟然減少，這可能是由于堿性較強的溶液中Mg2+易沉淀，從而影響酶活性。因此，本研究中重組細胞催化合成RA苷反應緩沖液的最佳pH為7.2。

2.4.3 MgCl2濃度的影響

考察了不同Mg2+濃度對全細胞催化合成RA苷的影響，結果如圖8所示。反應條件:檸檬酸鈉15 g/L，pH 7.2，30℃。

圖8 不同MgCl2濃度對全細胞催化的影響

催化反應MgCl2濃度在2～6 g/L時，RA苷生成量隨著MgCl2濃度的升高逐漸增加;RA苷量在MgCl2濃度6 g/L時達到最大值(187 mg/L)，之后驟然下降，MgCl2濃度為10 g/L時，RA苷的量較低。陳睦傳等人提出，催化合成UDPG的尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是依賴Mg2+的催化反應[11］，適宜濃度的Mg2+可以提高酶活。因此，本研究中重組細胞催化反應較佳MgCl2濃度為6 g/L。

2.4.4 溫度的影響

考察了不同溫度下重組菌催化合成RA苷量的變化，結果如圖9所示。反應條件:檸檬酸鈉15 g/L，MgCl26 g/L，pH 7.2。

圖9 不同溫度對全細胞催化的影響

當催化反應溫度≤37℃時，RA苷生成量隨著溫度的升高而增加，說明在25～37℃間提高溫度對RA苷量有一定促進作用。這可能是一方面溫度的提高，有利于提高重組菌的UGT76G1酶活性;另一方面可能是由于溫度變化時，酵母會在體內儲備糖原來應對暫時環(huán)境條件的變化[7-8］，而糖原合成途徑有利于促進UDPG生成。在37～42℃時，RA苷量逐步減少，這可能是由于太高的溫度影響了菌體內大部分酶的活性，有文獻提到，尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UDPG-PPLase于41℃時活性大部分喪失[11］。在37℃時，RA苷的量達到最高，為267.89 mg/L，因此，本研究中此全細胞催化反應以37℃為佳。

3 討論

本研究構建了表達甜葉菊UDP糖基轉移酶UGT76G1的重組釀酒酵母YPH499(pYES2-UGT)，將重組細胞用于催化合成RA苷的研究中。建立了通過調節(jié)酵母細胞內由葡萄糖合成UDPG的代謝途徑增強其通量的方法，優(yōu)化后重組細胞催化ST苷合成RA苷的反應條件為:ST苷1 g/L，葡萄糖20 g/L，普郎尼克F6810 g/L，MgCl26 g/L，檸檬酸鈉15 g/L，pH 7.2，細胞密度200 g濕細胞/L反應液，反應溫度37℃，反應時間48 h，優(yōu)化后RA苷的生成量可達267.89 mg/L。生物全細胞轉化方法提高RA苷相對含量的策略對于提高甜菊糖品質具有一定的潛在研究價值，對釀酒酵母UDPG相關代謝途徑的研究以及提高UGT76G1活性的相關研究將作為后繼工作的重點。

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ABSTRACTThe synthetic UDP glycosyl-transferase UGT76G1 coding gene with modification was inserted into the vector pYES2 with the restriction site of EcoR I and Xho I to construct the recombinant Saccharomyces cerevisiae YPH499(pYES2–UGT)strain，which can express UDP glycosyl-transferase UGT76G1.A whole cell catalysis method for adjusting UDPG synthesis metabolic pathway of the yeast cell was established by providing glucose for carbon source and enhancing the UDPG flux with the substrate Stevioside.The optimal conditions for the whole cell catalysis system were as follows:1 g/L Stevioside，20 g/L glucose，10 g/L PluronicF68，6 g/L MgCl2，15 g/L citric acid sodium，pH 7.2，the cell density was 200 g wet cells/L reaction solution，the reaction temperature was 37℃，the reaction time was 72 h.Under the optimal conditions，the output of Rebaudioside A could reach 267.89 mg/L.

Key wordsstevioside，rebaudioside A，glycosyl-transferase，UGT76G1，whole cell catalysis

Biosynthesis of Rebaudioside A by Whole Cell of Recominant Saccharomyces cerevisiae

Liu Huan，Li Yan，Yang Ming，Chen Sheng，Hao Ning，Xu Lin
(Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

碩士研究生(李艷為通訊作者)。

*國家自然科學基金項目(21106068);江蘇省自然科學基金項目(BK2011801);高等學校博士學科點專項科研基金(20113221120002);江蘇省普通高校自然科學研究計劃項目(10KJB530004)。

2012-03-14，改回日期:2012-05-03