王賀，楊瑞金，華霄，趙偉，張文斌

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú) 錫，214122)

利用枯草芽孢衣殼蛋白表面展示β-半乳糖苷酶*

王賀1，楊瑞金2，華霄2，趙偉2，張文斌2

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú) 錫，214122)

分別將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣殼蛋白CotB、CotC、CotG和CotX的啟動(dòng)子和編碼序列與來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)的β-半乳糖苷酶基因bgaB進(jìn)行重組，構(gòu)建融合表達(dá)cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重組質(zhì)粒。將4種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168(trp-)，獲得了能在芽孢表面展示的重組菌株P(guān)B701、PB702、PB703和PB704。經(jīng)Western blot檢測(cè)，4種重組菌株均表達(dá)了預(yù)期分子量的融合蛋白，初步表明β-半乳糖苷酶被錨定在重組菌株的芽孢表面。以oNPG為底物測(cè)定4種重組菌株芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的水解能力，得到的酶活分別為0.14、0.06、0.22和 0 .20 U/mL。

芽孢，表面展示，β-半乳糖苷酶，Western blot

枯草芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)在營(yíng)養(yǎng)匱乏、環(huán)境惡劣下，其自身的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞會(huì)形成一種休眠體，即芽孢[1］。芽孢位于菌體內(nèi)，由芽孢外壁、芽孢衣殼、皮層和核心構(gòu)成。芽孢能忍耐一些極端環(huán)境如高溫、高壓、化學(xué)藥物?？莶菅挎邨U菌是GRAS菌種之一，因而它產(chǎn)生的芽孢是安全無(wú)毒的[2］。芽孢表面展示技術(shù)作為新近發(fā)展起來(lái)的一門(mén)基因操作技術(shù)，已引起眾多學(xué)者廣泛關(guān)注。相對(duì)于其他表面展示技術(shù)，它雖起步較晚，但是具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于口服疫苗、醫(yī)藥和全細(xì)胞催化劑等領(lǐng)域[3］。

實(shí)現(xiàn)芽孢表面展示技術(shù)的關(guān)鍵是需要一種高豐富度、表面結(jié)合能力強(qiáng)的芽孢衣殼蛋白。芽孢衣殼蛋白層一般是由超過(guò)50余種的蛋白質(zhì)構(gòu)成，分外層和內(nèi)層。目前，已被成功應(yīng)用的芽孢衣殼蛋白則都是來(lái)源于外層，如CotB、CotC、CotG和CotX[4-7］。從現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，CotB和CotC常用于錨定抗原制備疫苗，而CotG則錨定酶蛋白發(fā)揮全細(xì)胞催化劑功能。通過(guò)芽孢表面展示技術(shù)將功能活性酶展示在芽孢表面作為全細(xì)胞催化劑已成當(dāng)前表面展示技術(shù)研究的熱點(diǎn)。本研究以β-半乳糖苷酶為目標(biāo)蛋白，選用CotB、CotC、CotG和CotX四種芽孢衣殼蛋白作為分子載體，將β-半乳糖苷酶展示于芽孢表面，并比較了4種分子載體的展示能力，從而篩選出能夠適合展示β-半乳糖苷酶的分子載體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、主要試劑

嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)作為PCR擴(kuò)增β-半乳糖苷酶基因bgaB的出發(fā)菌株?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis 168(trp-))和大腸桿菌(Escherichia coli Top10)均為本實(shí)驗(yàn)室保存，分別作為表達(dá)宿主和克隆宿主。攜帶有紅霉素抗性基因的質(zhì)粒pJS700a由江蘇大學(xué)寧德剛博士惠贈(zèng)。高保真Prime STARS HS DNA聚合酶、pMD-19T、各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物(大連)有限公司;小型質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天澤基因生物科技有限公司;增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京天恩根生化科技有限公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自Invitrogen-Life technology;兔抗β-半乳糖苷酶血清為實(shí)驗(yàn)室前期制備。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純級(jí)。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，在需要時(shí)分別加入氨芐青霉素(50 μg/mL)和紅霉素(10 μg/mL);LB中添加1%淀粉用于篩選枯草轉(zhuǎn)化子;DSM培養(yǎng)基[8］誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生芽孢。

1.2 cotB、cotC、cotG、cotX和bgaB的擴(kuò)增

用于擴(kuò)增4種芽孢衣殼蛋白和bgaB基因的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，其中用于擴(kuò)增4種芽孢衣殼蛋白基因的下游引物中均不含有終止密碼子。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物

采用上海生工細(xì)菌基因組快速提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌的染色體。擴(kuò)增4種芽孢衣殼蛋白的反應(yīng)程序如下:95℃5 min，95℃1 min，62℃1 min，72℃1.5 min，35循環(huán)。以bgaB-F和bgaB-R為引物、提取的B.stearothermophilus IAM11001基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增bgaB。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后分別連接于pMD-19T，送上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 DNA操作

DNA的酶切、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌均按照分子克隆標(biāo)準(zhǔn)[9］方法進(jìn)行。質(zhì)粒DNA的小量制備、酶切產(chǎn)物回收均按試劑盒方法進(jìn)行。

1.4 兩步法轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌

采用Spizizen法[10］制備B.subtilis 168感受態(tài)細(xì)胞，其中SpII中1×CAYE所占的體積比由1%減少到0.1%。轉(zhuǎn)化完畢后涂布在含10 μg/mL紅霉素的LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行篩選鑒定。

1.5 枯草芽孢桿菌的淀粉酶活性分析

從平板上挑取單菌落點(diǎn)接在含1%淀粉的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h以上，噴灑碘液。

1.6 芽孢懸浮液的制備及其芽孢衣殼蛋白的提取

采用DSM培養(yǎng)基作為枯草芽孢桿菌生產(chǎn)芽孢的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體成分參見(jiàn)文獻(xiàn)[8］。按1%接種量(V/V)轉(zhuǎn)接至DSM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。收集菌體，分別用1 mol/L的NaCl和KCl洗滌菌體，最后用無(wú)菌水懸浮，加入終濃度為5 mg/mL的溶菌酶，于37℃處理2h除去營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，離心去上清。參照SDSDTT法[11］提取芽孢衣殼蛋白。

1.7 Western blot分析

取1mL的芽孢衣殼蛋白溶液，加入等體積的上樣緩沖液煮沸5～10 min，離心取上清進(jìn)行SDSPAGE。蛋白電泳完畢，將分離膠浸在TBST緩沖液中平衡10 min，電轉(zhuǎn)條件:80V，2 h。電轉(zhuǎn)使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(NC)，然后將膜在封閉液中4℃過(guò)夜。封閉后，分別加入一抗兔抗β-半乳糖苷酶血清，室溫反應(yīng)2 h，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，最后用增強(qiáng)型的HRP-DAB底物試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.8 β-半乳糖苷酶的酶活測(cè)定

以oNPG作為底物，制備的重組芽孢懸浮液為酶液進(jìn)行反應(yīng)。取0.8 mL的oNPG溶液(2.5 g/L)于75℃下預(yù)熱2 min，接著加入0.2 mL芽孢懸浮液進(jìn)行反應(yīng)，保溫5 min，然后加入1 mL 10%Na2CO3溶液終止反應(yīng)。分光光度計(jì)法測(cè)定反應(yīng)液在420 nm的吸光值OD420，計(jì)算產(chǎn)生的oNP的量。酶活單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol oNP所需要的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 cotB、cotC、cotG 、cotX和bgaB的擴(kuò)增與融合表達(dá)的整合型重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以B.subtilis 168(trp-)基因組DNA為模板、以cotB-F/cotB-R、cotC-F/cotC-R、cotG-F/cotG-R和cotXF/cotX-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增4種芽孢衣殼蛋白基因，然后電泳回收PCR產(chǎn)物。以B.stearothermophilus IAM11001基因組DNA為模板和bgaB-F/bgaB-R為引物，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小為2.0 kb。上述5個(gè)PCR產(chǎn)物純化后與pMD-19T連接、送樣、測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有序列堿基完全正確。用XbaI/KpnI酶切與pMD-19T連接的4種重組質(zhì)粒，回收cotB、cotC、cotG和cotX片段，克隆到pJS700a[12］的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pJSB、pJSC、pJSG和pJSX。以KpnI/EcoRI雙切pMD-19T-bgaB，回收bgaB片段并克隆于上述4個(gè)重組質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)中，得到質(zhì)粒pJSBB、pJSCB、pJSGB和pJSXB(圖1)。其中每個(gè)融合基因的轉(zhuǎn)錄都受自身啟動(dòng)子控制。

圖1 融合表達(dá)cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖

圖2 雙酶切重組質(zhì)粒pJSBB、pJSCB、pJSGB和pJSXB核酸電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌與轉(zhuǎn)化子的鑒定

采用修改的Spizizen法轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。首先以BglII線性化重組質(zhì)粒，兩步法轉(zhuǎn)化B.subtilis 168(trp-)。重組質(zhì)粒上的整合片段含有部分淀粉酶基因，與宿主菌染色體上的同源片段發(fā)生雙交換，進(jìn)而將融合基因整合到染色體上。以含有10 μg/mL紅霉素的LB平板進(jìn)行初篩，然后采用含1%淀粉的LB平板對(duì)重組菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示菌落自身及周?chē)蝗境伤{(lán)色的轉(zhuǎn)化子，表明其中的淀粉酶因融合基因插入失活，導(dǎo)致不能產(chǎn)生淀粉酶，所以菌落被碘液染成藍(lán)色。而對(duì)照菌的菌落及周?chē)鷦t產(chǎn)生透明的淀粉水解圈。表明融合基因已被成功整合到枯草芽孢桿菌的染色體上。4個(gè)鑒定后的轉(zhuǎn)化子分別命名為PB701、PB702、PB703、PB704。

圖3 重組菌株淀粉酶活性分析。

2.3 Western blot分析表面展示β-半乳糖苷酶重組芽孢

為進(jìn)一步分析β-半乳糖苷酶是否被錨定在芽孢的表面，以稀釋后的兔抗β-半乳糖苷酶血清為一抗，Western blot檢測(cè)重組菌株的芽孢衣殼蛋白。重組菌經(jīng)與特異HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗反應(yīng)后，加入增強(qiáng)型的HRP-DAB的底物試劑盒顯色反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot分析

從圖4看出，在所有重組菌株中都會(huì)出現(xiàn)一條在85 ku附近的雜交條帶，而空白對(duì)照則無(wú)任何雜交條帶，β-半乳糖苷酶在圖上顯示了分子量偏低的條帶。Western blot結(jié)果表明β-半乳糖苷酶利用芽孢衣殼蛋白可以被錨定在芽孢的表面。從圖4還可以看出，重組菌株P(guān)B702表達(dá)的蛋白條帶最淺，而重組菌株P(guān)B703表達(dá)的蛋白條帶最深。

2.4 重組菌株芽孢表面展示 β-半乳糖苷酶活性分析

以oNPG為底物對(duì)重組菌株P(guān)B701、PB702、PB703和PB704芽孢表面展示的β-半乳糖苷酶的活性測(cè)定結(jié)果如圖5。圖5顯示重組菌株P(guān)B702芽孢表面展示的酶活最低，而重組菌株P(guān)B703和PB704芽孢表面展示的酶活最高，分別為0.22和0.20 U/mL，表明以芽孢衣殼蛋白CotG和CotX作為分子載體展示β-半乳糖苷酶的效果更好。

圖5 枯草芽孢桿菌芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的測(cè)定結(jié)果

3 討論

由于枯草芽孢桿菌具有較高的安全性和穩(wěn)定性?xún)?yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始用其展示不同的蛋白或抗原。芽孢表面展示技術(shù)的關(guān)鍵是用于錨定的芽孢衣殼蛋白。雖然目前報(bào)道的已有3種芽孢衣殼蛋白用作分子載體，但是篩選新的能有效展示外源蛋白的芽孢衣殼蛋白意義仍然十分重大。本文研究了4種不同芽孢衣殼蛋白CotB、CotC、CotG和CotX作為分子載體展示β-半乳糖苷酶并測(cè)定了4個(gè)重組菌株芽孢表面展示的酶活。結(jié)果顯示重組菌株P(guān)B703芽孢表面展示的酶活最高，其次是重組菌株P(guān)B704，而重組菌株P(guān)B702則最小，表明CotG和CotX能有效地展示β-半乳糖苷酶。CotB和CotC一般被用來(lái)錨定抗原制備疫苗如破傷風(fēng)毒素TTFC，大腸桿菌的不耐熱毒素B亞單位等，而CotG則被廣泛用于錨定酶制備全細(xì)胞催化劑如ω-轉(zhuǎn)氨酶、N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸醛縮酶等[13-15］。Hinc等人[16］將幽門(mén)螺桿菌尿素酶A亞單位(UreA)分別融合到CotB、CotC和CotG上，結(jié)果顯示CotC最適合UreA的表達(dá)，而CotB最適合融合蛋白在芽孢表面的展示。表明使用不同的錨定蛋白對(duì)展示的蛋白活性有較大影響，主要與錨定蛋白自身性質(zhì)有關(guān)。李倩等人[7］報(bào)道了一種新的芽孢衣殼蛋白(CotX)可以作為分子載體，但未見(jiàn)報(bào)道用于固定生物酶。在本研究中發(fā)現(xiàn)，CotX可以有效地錨定β-半乳糖苷酶在芽孢表面，而且獲得較高的酶活，同時(shí)本研究可為其他酶制劑固定提供參考。

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ABSTRACTIn this work，we developed an efficient spore display system that a model protein β-galactosidase was anchored on the spore surface of Bacillus subtilis 168 based on the use of spore coat proteins.The PCR-amplifying cotB，cotC，cotG and cotX were ligated with pMD-19T and digested with XbaI and KpnI，and then subcloned into vector pJS700a previously digested with the same two restriction enzymes，finally resulted in the plasmids pJSB，pJSC，pJSG and pJSX.To construct the gene fusions，the bgaB from Bacillus stearothermophilus IAM11001 was cloned into the KpnI and EcoRI sites of plasmid pJSB，pJSC，pJS G and pJSX to generate generating the plasmids pJSBB，pJSCB，pJSGB and pJSXB，respectively After linearization with BglII restriction endonuclease，the four recombinant integrative plasmids were transformed into B.subtilis 168 to yield the recombinant strain PB701，PB702，PB703 and PB704，respectively.Results from Western blot analysis showed that the fusion protein was immobilized on the spore surface.Using oNPG as substrate，the enzyme activity of spore-displaying β-galactosidase was assayed and they were 0.14，0.06，0.22 and 0.20 U/mL for PB701，PB702，PB703 and PB704，respectively.This result suggested that the fusion proteins could be successfully expressed and located on the spore surface of B.subtilis.

Key wordsspore，surface display，β-galactosidase，Western blot

Functional Display of β-galactosidase on the Spore Surface of Bacillus subtilis Using Spore Coat Protein as Anchor Motif

Wang He1，Yang Rui-jin2，Hua Xiao2，Zhao Wei2，Zhang Wen-bin2
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

博士研究生(楊瑞金教授為通訊作者)

*國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z336);江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向資助項(xiàng)目(SKLF-MB-200804);以乳糖異構(gòu)化為目標(biāo)的葡萄糖異構(gòu)酶定向改造研究(SKLFTS-200903);江南大學(xué)博士研究生科學(xué)研究基金項(xiàng)目

2012-02-21，改回日期:2012-03-30