廖玉婷 葉 劍 李 青 張曉丹 齊 暉 李富榮

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)干細(xì)胞與細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室，深圳518020)

胰島移植是治愈糖尿病的潛在治療方法之一，但目前仍然面臨著供體不足和免疫排斥等難題。α1-抗胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin，AAT)是體內(nèi)的一種重要絲氨酸蛋白酶抑制劑。最近研究發(fā)現(xiàn)AAT有保護(hù)胰島細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)、抗凋亡和誘導(dǎo)特異性免疫耐受的作用。NIT-1細(xì)胞系是非肥胖糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠來源的胰島β細(xì)胞系，能穩(wěn)定分泌胰島素，常作為細(xì)胞模型用于糖尿病的研究［1］。本研究旨在建立穩(wěn)定表達(dá)人AAT基因NIT-hAAT細(xì)胞系，并觀察hAAT在糖尿病細(xì)胞治療中對(duì)β細(xì)胞的免疫保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 攜帶人AAT基因的原核質(zhì)粒pBS-RSV-hAAT由美國(guó)華盛頓大學(xué)Andre Lieber教授惠贈(zèng)。真核質(zhì)粒載體 pDsRed-N111和大腸桿菌DH-5α均由北京大學(xué)深圳研究生院盧智剛教授惠贈(zèng)。小鼠胰島NIT-1細(xì)胞株(20-40代)由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科的李芳萍主任惠贈(zèng)，在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4到5周齡雄性BALB/c小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

PCR試劑購(gòu)自Fermentas公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司;限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、XhoⅠ、ApaLⅠ，連接酶及去磷酸化酶購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及Western blot化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自Thermo公司;人α1-抗胰蛋白酶抗體購(gòu)自GeneTex公司;二抗山羊抗兔IgG購(gòu)自SouthernBiotech公司;鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購(gòu)自ALEXIS公司;鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自Millipore公司;血糖試紙及血糖儀購(gòu)自Lifescan公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì) 按hAAT編碼區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。上游引物 P1:5'-，斜 體 部 分 為BglⅡ酶切位點(diǎn);下游引物P2:5'-ACTCGAGCTCCAGCTCAACCCTT-3'，斜體部分為Xho I酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1．2．2 pDsRed-N111-hAAT重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 PCR擴(kuò)增pBS-RSV-hAAT質(zhì)粒的hAAT基因，電泳純化回收。用BglⅡ和XhoⅠ雙酶切hAAT基因和 pDsRed-N111質(zhì)粒，經(jīng)去磷酸化酶后，在22℃連接1．5到2小時(shí)，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在卡那霉素(100 μg/ml)藥物篩選12到14小時(shí)，挑6個(gè)陽性單克隆進(jìn)行搖菌、提取質(zhì)粒。以pDsRed-N111質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，采用BglⅡ和XhoⅠ雙酶切及測(cè)序鑒定。

1．2．3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及 NIT-hAAT細(xì)胞系的建立ApaLⅠ酶切線性化處理pDsRed-N111-hAAT質(zhì)粒，切膠回收。NIT-1細(xì)胞培養(yǎng)到80%到90%融合度后，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以pDsRed-N111空載體作為對(duì)照組，具體轉(zhuǎn)染方法參照試劑盒說明。G418(濃度為350 μg/ml)進(jìn)行篩選，每3天換一次液，篩選14天。挑取單克隆，在含175 μg/ml G418的DMEM進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，建立NIT-hAAT細(xì)胞系。

1．2．4 Western blot 裂解3×107個(gè)穩(wěn)定表達(dá)pD-sRed-N111-hAAT的NIT-1細(xì)胞，以pDsRed-N111質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為空白對(duì)照，得到100 μl蛋白樣品進(jìn)行蛋白印跡分析。具體的操作方法參照相關(guān)文獻(xiàn)［2-5］，選用的一抗?jié)舛认♂尡稊?shù)為1∶500，二抗則為 1∶1 000。

1．2．5 糖尿病模型小鼠的制備 70只BALB/c小鼠連續(xù)5天腹腔注射STZ 40 mg/kg。5天后禁食6到8小時(shí)，進(jìn)行斷尾采血測(cè)血糖，血糖值連續(xù)2次≥250 mg/dl造模成功。將糖尿病模型小鼠隨機(jī)分為3組(每組22只):NIT-hAAT組、NIT組和糖尿病組(假手術(shù)組);另15只正常小鼠為正常對(duì)照組。

1．2．6 細(xì)胞移植 在小鼠成模第5天，水合氯醛麻醉小鼠、NIT-hAAT組和NIT組糖尿病小鼠分別在左腎包膜下移植1．5×107個(gè)NIT-hAAT細(xì)胞和NIT-1細(xì)胞;糖尿病組作為假移植組，手術(shù)操作同上，注射10 μl PBS 緩沖液。

1．2．7 檢測(cè)指標(biāo) 血糖和生存期的檢測(cè):術(shù)后第1到7天，每天對(duì)各組小鼠進(jìn)行斷尾采血測(cè)血糖;術(shù)后第14到30天，每3天測(cè)血糖1次;第31到60天每周測(cè)血糖1次，每次隨機(jī)檢測(cè)5只小鼠，如果連續(xù)2次＜250 mg/dl，則定義為血糖正常。觀察記錄小鼠的生存期，檢測(cè)期間取樣處死的小鼠不計(jì)入統(tǒng)計(jì)資料。

ELISA 檢測(cè)胰島素水平:在術(shù)后第 3、7、14、28和42天，每組分別取3只小鼠進(jìn)行心臟取血(處死)，離心分離血清，小鼠胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)血清中胰島素水平，具體操作參照說明書進(jìn)行。

RT-PCR檢測(cè)左腎中移植細(xì)胞的hAAT表達(dá):在術(shù)后第7、14、28和42天，取NIT-hAAT組和NIT組3只小鼠的左腎在液氮中研磨，提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行hAAT基因的PCR擴(kuò)增。體外對(duì)NIT-hAAT細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取1．5×107個(gè)第20代細(xì)胞、糖尿病組和正常組小鼠左腎作為對(duì)照。上游引物P1:5'-GTACCCTAAACCAGCCAGACAG-3';下游引物P2:5'-GCTTCATCATAGGGACCTTCAC-3'，反應(yīng)條件參考參照相關(guān)文獻(xiàn)［2，6］。

病理學(xué)觀察:在術(shù)后第28天和42天各組處死2只受體鼠取左腎，在福爾馬林中固定24小時(shí)后，石蠟包埋，制成5 μm切片，HE染色觀察移植部位炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2 結(jié)果

2．1 重組真核質(zhì)粒pDsRed-N111-hAAT的構(gòu)建及酶切鑒定 hAAT基因的約為1 350 bp，見圖1A。圖1B是BglⅡ和XhoⅠ雙酶切后的pDsRed-N111質(zhì)粒片段和hAAT基因片段，pDsRed-N111線性質(zhì)粒片段約為3 300 bp。PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果:6個(gè)菌落中有4個(gè)能得到正確的hAAT基因條帶和與預(yù)期大小相符的酶切片段，以pD-sRed-N111質(zhì)粒為對(duì)照的酶切鑒定圖譜見圖1C。

對(duì)重組真核質(zhì)粒pDsRed-N111-hAAT進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所得到的hAAT編碼區(qū)基因的核苷酸序列與Andre Lieber教授的相一致，插入位點(diǎn)正確。

2．2 NIT-hAAT細(xì)胞系的建立及鑒定 pDsRed-N111-hAAT轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞，以pDsRed-N111為空白對(duì)照。G418篩選14天后得到NIT-hAAT細(xì)胞系。Western blot顯示NIT-hAAT細(xì)胞中出現(xiàn)分子量約55 kD的條帶，對(duì)照細(xì)胞沒有陽性表達(dá)，見圖2。上述結(jié)果顯示所構(gòu)建的表達(dá)載體在NIT-hAAT細(xì)胞中表達(dá)人AAT蛋白。

圖1 重組真核質(zhì)粒pDsRed-N111-hAAT的構(gòu)建及酶切鑒定Fig．1 Construction and restriction enzyme digestion of recombinant eukaryotic plasmid pDsRed-N111-hAAT

圖2 NIT-hAAT細(xì)胞的Western blot分析Fig．2 Western blot result of NIT-hAAT cells

2．3 NIT-hAAT移植對(duì)糖尿病小鼠血糖和生存期的影響 NIT-hAAT組和NIT組受體鼠接收細(xì)胞移植后，3天后血糖明顯下降，見圖3。NIT-hAAT組小鼠血糖水平降至接近正常小鼠，而且維持35天后開始出現(xiàn)血糖逐漸升高，至56天近似糖尿病小鼠血糖水平。NIT組小鼠在移植14天后，小鼠血糖即開始持續(xù)升高，28天升至糖尿病小鼠水平。

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠60天生存期觀察，正常組小鼠全部存活，糖尿病組小鼠在30天前已全部死亡。NIT-hAAT組小鼠的生存率為40%，NIT組小鼠的生存率為10%。NIT-hAAT組小鼠的生存期較NIT組小鼠明顯延長(zhǎng)(P＜0．01)，見圖4。

2．4 NIT-hAAT移植對(duì)胰島素水平的影響 對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清胰島素水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NIT-hAAT組小鼠的胰島素水平在第3天至35天與正常組小鼠無明顯差異(P＞0．05)，42天后開始明顯低于正常組小鼠(P ＜0．05)，但仍然高于糖尿病組小鼠(P ＜0．05)。NIT組小鼠胰島素水平在第3天至14天時(shí)與正常組無明顯差異(P＞0．05)，28天后胰島素水平明顯下降，接近糖尿病組小鼠的水平(P＞0．05)，見圖5。

圖3 細(xì)胞移植后各組受體鼠的血糖變化(n=5)Fig．3 Blood glucose levels of diabetic mice after cell transplantation(n=5)

圖4 細(xì)胞移植后各組受體鼠的生存率變化(n=10)Fig．4 Survival time of diabetic mice after cell transplantation(n=10)

圖5 細(xì)胞移植后各組血清胰島素水平的比較(n=3)Fig．5 The serum insultin level of diabetic mice after cell transplantation(n=3)

圖6 RT-PCR檢測(cè)小鼠左腎的移植細(xì)胞hAAT表達(dá)量Fig．6 The hAAT expression of diabetic mice after cell transplantation by RT-PCR

2．5 NIT-hAAT細(xì)胞在體內(nèi)的表達(dá)情況 RT-PCR的電泳結(jié)果中，第20代的NIT-hAAT細(xì)胞依然能穩(wěn)定表達(dá) hAAT，目的條帶約 366 bp，見圖 6。NIT-hAAT細(xì)胞移植后的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間出現(xiàn)hAAT表達(dá)量逐漸減弱的趨勢(shì)，而糖尿病小鼠和正常小鼠的腎組織不表達(dá)hAAT。

2．6 病理學(xué)觀察 在移植后28天，對(duì)移植組小鼠的左腎進(jìn)行HE染色，NIT-hAAT細(xì)胞和NIT-1細(xì)胞在鏡下的形態(tài)相似，其細(xì)胞大小不等、形態(tài)不一，細(xì)胞核漿比大于正常細(xì)胞。在NIT-hAAT組腎包膜下移植部位，有少量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，大部分移植細(xì)胞仍然存活，結(jié)構(gòu)正常，只有炎癥反應(yīng)。NIT組腎包膜下移植部位，見有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并呈現(xiàn)纖維化狀態(tài)，移植部位只有少量移植NIT-1細(xì)胞存在。移植42天時(shí)，NIT-hAAT組腎包膜下移植部位也出現(xiàn)大范圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有部分細(xì)胞組織呈纖維化改變，但仍有移植細(xì)胞存在;NIT組小鼠的移植部位沒有見到移植細(xì)胞，主要呈纖維化狀態(tài)，見圖7。

圖7 細(xì)胞移植后各組小鼠左腎組織的病理HE染色(SP，×200)Fig．7 The pathological HE staining of left kidneys in diabetic mice after cell transplantation(SP，×200)

3 討論

自埃德蒙頓(Edmonton)方案之后，胰島細(xì)胞移植被認(rèn)為是目前最有希望治愈Ⅰ型糖尿病的方法之一，但在臨床隨訪報(bào)告中顯示糖尿病患者接受移植5年后，胰島素停用率只有10%［7］。其主要的原因，一方面是受體對(duì)植入胰島的同種異體免疫排斥，另一方面是Ⅰ型糖尿病受體對(duì)胰島β細(xì)胞自身免疫攻擊導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑是一個(gè)蛋白超家族，在多種動(dòng)物和植物物種中均有發(fā)現(xiàn)，對(duì)絲氨酸蛋白酶有調(diào)控功能［8］。而AAT是最廣泛存在于動(dòng)物血清中的絲氨酸蛋白酶抑制劑，能夠抑制體內(nèi)多種蛋白酶的活性;同時(shí)，還是一種抗炎癥的急性期反應(yīng)物，能保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞和器官，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡［9］。但不同物種的AAT表達(dá)基因的數(shù)目不一，人AAT是由一條單基因編碼，其蛋白氨基酸序列有60%與鼠源的AAT相一致;而豚鼠、兔和大部分實(shí)驗(yàn)小鼠的AAT是由3～5個(gè)基因序列控制編碼，具有多個(gè)蛋白亞型，其中BALB/c小鼠的AAT亞型有7個(gè)［8，10］。人和小鼠 AAT是同源蛋白，都作為自殺型抑制劑與目標(biāo)絲氨酸蛋白酶形成1∶1的滅活復(fù)合物［10］。人AAT的第353個(gè)氨基酸位點(diǎn)是重要的反應(yīng)中心位點(diǎn)，C57BL/6鼠的5個(gè)AAT亞型中有3個(gè)相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)與人AAT相一致。而這些亞型的反應(yīng)中心位點(diǎn)差異，使其與絲氨酸蛋白酶形成共價(jià)復(fù)合物能力的不同［10，11］。在臨床上，hAAT治療因AAT缺失而引起的慢性阻塞性肺疾病，已經(jīng)有接近20年時(shí)間，具有顯著的安全記錄［9］。最新研究發(fā)現(xiàn)，hAAT用于胰島移植的實(shí)驗(yàn)中，具有抗凋亡和誘導(dǎo)特異性免疫耐受的特性［6，12，13］。

本研究以NIT-1細(xì)胞系為研究平臺(tái)，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)hAAT的胰島β細(xì)胞系(NIT-hAAT)，觀察移植細(xì)胞自身分泌的hAAT能否保護(hù)移植物免受免疫排斥的作用。體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NIT-1細(xì)胞在14天后即開始出現(xiàn)血糖上升和胰島素水平明顯下降，表明移植的NIT-1細(xì)胞很快出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，移植細(xì)胞失去胰島素分泌功能。而NIT-hAAT細(xì)胞在移植后能穩(wěn)定表達(dá)胰島素，維持血糖呈正常水平至35天，表明hAAT的表達(dá)可抑制受體鼠對(duì)移植NIT-1細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)，顯著延長(zhǎng)了移植細(xì)胞的存活時(shí)間，病理學(xué)也證實(shí)hAAT在28天時(shí)可明顯減輕炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，但在42天時(shí)仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這與 Lewis等［6，12］研究結(jié)果相符，他們以hAAT作為同種異體移植的體外單一輔助治療劑，發(fā)現(xiàn)hAAT通過抑制白細(xì)胞分泌IL-8以及減少單核細(xì)胞趨化蛋白和細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)，最終抑制中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;與此同時(shí)，hAAT能抑制巨噬細(xì)胞的遷移，減少TNF-α和IL-1β的分泌和NK細(xì)胞和CD3+細(xì)胞的聚集，緩解了胰島移植的急性炎癥，延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間［6，14-16］。

從RT-PCR結(jié)果中看出，在移植后期NIT-hAAT細(xì)胞逐漸失去功能?？赡艿脑蚴牵浦布?xì)胞hAAT分泌量不足，隨著免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，hAAT的表達(dá)量也隨之下降，因此，其難以發(fā)揮全身的免疫調(diào)節(jié)作用［17］，只能在移植細(xì)胞外周形成暫時(shí)性局部的免疫保護(hù)，難以長(zhǎng)期抵抗全身性的免疫系統(tǒng)的攻擊作用。另一方面移植細(xì)胞表達(dá)的hAAT是人源的蛋白酶，雖人和鼠的AAT是同源蛋白，在鼠中也同樣發(fā)揮作用，但其局部結(jié)構(gòu)的差異仍容易誘發(fā)小鼠對(duì)hAAT的免疫抵抗作用。Lewis等［12］發(fā)現(xiàn)受體鼠對(duì)外源的hAAT會(huì)產(chǎn)生抗體，其產(chǎn)生的時(shí)間與hAAT注射量和注射時(shí)間有關(guān)，它抑制hAAT的免疫保護(hù)作用，影響移植物的存活時(shí)間。在本研究中，我們證明了移植NIT-hAAT細(xì)胞由于可以分泌hAAT，對(duì)抑制的NIT-1細(xì)胞起到了免疫保護(hù)作用，但存在細(xì)胞表達(dá)的hAAT不能誘導(dǎo)免疫耐受的形成，仍然出現(xiàn)炎性反應(yīng)，使移植的NIT-hAAT細(xì)胞發(fā)生凋亡。如何利用hAA的抗炎癥、抗凋亡能力和誘導(dǎo)免疫耐能力來保護(hù)移植的胰島細(xì)胞的分子作用機(jī)制仍需要進(jìn)行深入研究。

1 Hoang P T，Park P，Cobb L J et al．The neurosurvival factor humanin inhibits beta-cell apoptosis via signal transducer and activator of transcription 3 activation and delays and ameliorates diabetes in nonobese diabetic mice［J］．Metabolism，2010;59(3):343-349．

2 郭靜雅，朱華亭，陳昌友 et al．轉(zhuǎn)染小鼠CXCR3基因的B16-mCXCR3細(xì)胞在體內(nèi)外遷移和致瘤作用研究［J］．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011;27(1):25-33．

3 黃立軍，王云杰，楊彤濤et al．人α-1抗胰蛋白酶基因的克隆及在cos-7細(xì)胞中的表達(dá)［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2005;13(1):13-15．

4 陸樹洋，王春生，宋 凱et al．a(chǎn)lpha-1抗胰蛋白酶在升主動(dòng)脈夾層及瘤樣擴(kuò)張血管組織中的表達(dá)［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010;27(5):564-566．

5 陳 亮，溫桂蘭，許 飛．小鼠IL-10重組慢病毒載體的構(gòu)建和病毒包裝［J］．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011;27(6):540-544．

6 Lewis E C，Mizrahi M，Toledano M et al．Alpha 1-Antitrypsin monotherapy induces immune tolerance during islet allograft transplantation in mice［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008;105(42):16236-16241．

7 陳 麗．胰島細(xì)胞移植治療1型糖尿病現(xiàn)狀與未來［J］．醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版)，2009;30(12):9-12．

8 Barbour K W，Wei F，Brannan C et al．The murine alpha(1)-proteinase inhibitor gene family:polymorphism，chromosomal location，and structure［J］．Genomics，2002;80(5):515-522．

9 廖玉婷，李富榮．α1-抗胰蛋白酶在胰島移植和Ⅰ型糖尿病中的作用［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011;27(8):935-937．

10 Borriello F，Krauter K S．Multiple murine alpha 1-protease inhibitor genes show unusual evolutionary divergence［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1991;88(21):9417-9421．

11 Daemen M，Heemskerk V H，van't Veer C et al．Functional protection by acute phase proteins alpha(1)-acid glycoprotein and alpha(1)-antitrypsin against ischemia/reperfusion injury by preventing apoptosis and inflammation［J］．Circulation，2000;102(12):1420-1426．

12 Lewis E C，Shapiro L，Bowers O J et al．Alpha 1-antitrypsin monotherapy prolongs islet allograft survival in mice［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(34):12153-12158．

13 Zhang B，Lu Y Q，Campbell-Thompson M et al．Alpha 1-antitrypsin protects beta-cells from apoptosis［J］．Diabetes，2007;56(5):1316-1323．

14 Weir G C，Koulamnda M．Control of inflammation with alpha1-antitrypsin:a potential treatment for islet transplantation and new-onset type 1 diabetes［J］．Curr Diab Rep，2009;9(2):100-102．

15 Pileggi A，Molano R D，Song S et al．Alpha-1 antitrypsin treatment of spontaneously diabetic nonobese diabetic mice receiving islet allografts［J］．Transplant Proc，2008;40(2):457-458．

16 Koulmanda M，Bhasin M，Hoffman L et al．Curative and beta cell regenerative effects of alpha1-antitrypsin treatment in autoimmune diabetic NOD mice［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008;105(42):16242-16247．

17 Molano R D，Pileggi A，Song S et al．Prolonged islet allograft survival by alpha-1 antitrypsin:the role of humoral immunity［J］．Transplant Proc，2008;40(2):455-456．