張昕悅，張秀軍，*，何聰芬，高 路

(1.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000;2.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京100048)

綠膿桿菌分子生物學(xué)檢測的研究進(jìn)展

張昕悅1，張秀軍1，*，何聰芬2，高 路2

(1.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000;2.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京100048)

綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種臨床上常見的條件致病菌。近年來其檢測技術(shù)取得了一定進(jìn)展，本文對綠膿桿菌的分子生物學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)行了綜述，并對其檢測新策略進(jìn)行了展望。

綠膿桿菌，分子生物學(xué)，檢測

Abstract:Pseudomonas aeruginosa is a common opportunistic pathogen.Some improvement has been made on its relevant detection technique in recent years.The molecular detections of Pseudomonas aeruginosa and some new promising strategies about its testing were summarized in the review.

Key words:Pseudomonas aeruginosa;molecular biology;detection

綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)亦稱銅綠假單胞菌，是一種常見的條件致病菌，自然界廣泛分布于空氣、水和土壤中。該菌可以產(chǎn)生包括多糖莢膜、黏附素、內(nèi)毒素和外毒素在內(nèi)的多種致病因子，并通過阻止真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、催化過氧化氫和超氧化物產(chǎn)生有毒氧基團(tuán)的方式引起機(jī)體組織損傷。該菌附著在人身上可引起人皮膚化膿性感染，特別是患者的燒傷或燙傷部位被感染后，常會使病情惡化，并可能引起敗血癥［1］。此外，綠膿桿菌也可以通過污染食品而造成食物中毒。目前我國對綠膿桿菌的檢測主要停留在細(xì)胞培養(yǎng)階段，該方法存在特異性與敏感性低、耗時長、診斷方法繁瑣、確診率低等缺陷，不宜用于大規(guī)模食品、化妝品、環(huán)境樣品檢測推廣，另外在臨床上還有可能延誤診斷和治療。因此，研究綠膿桿菌的分子生物學(xué)檢測方法具有十分重要的現(xiàn)實意義，本文對相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

1 傳統(tǒng)的綠膿桿菌檢測方法

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)法

傳統(tǒng)檢測綠膿桿菌的方法就是通過選擇性增菌、接種、分離、生化鑒定等方法對待檢樣品可能存在的綠膿桿菌進(jìn)行定性和定量的檢測。其中選擇性增菌用的是SCDLP增菌液;梯度稀釋菌液后接種平板可以定量計數(shù);分離培養(yǎng)用到CFC平板與CN平板置于36℃培養(yǎng)24h;依據(jù)綠膿桿菌氧化酶、硝酸鹽還原、明膠液化實驗、乙酰胺、葡萄糖酸鹽、精氨酸雙水解酶實驗呈陽性，革蘭氏染色、賴氨酸脫羧酶實驗為陰性，42℃瓊脂斜面上能生長等生化鑒定特征［2］，報告樣品中是否檢出綠膿桿菌。培養(yǎng)法簡單易行，結(jié)果準(zhǔn)確，但耗時長及其繁瑣的步驟是該方法發(fā)展難以突破的瓶頸。

1.2 VITEK檢測法

VITEK全自動微生物分析系統(tǒng)是法國biosMerieumx生產(chǎn)的全自動微生物分析儀的一個系列，是目前世界上最先進(jìn)、自動化程度最高的細(xì)菌鑒定器之一，儀器的原理是依據(jù)細(xì)菌的生化反應(yīng)，即把30個對細(xì)菌鑒定必需的生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過自動試卡閱讀器按光學(xué)掃描原理，定時測定各生長介質(zhì)中指示劑的顯色或濁度反應(yīng)，形成各自特有的“代謝指紋圖譜”，通過計算機(jī)分析處理，從而獲得鑒定［3］。該方法具有高度的特異性、敏感性和重復(fù)性，操作簡便，檢測速度快。但是其鑒定結(jié)果受到多種因素的影響，仍有一些菌不能經(jīng)VITEK進(jìn)行有效鑒定。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因包括:待檢菌不純;接種濁度不合要求;接種物孵育時間過長;超出實驗卡鑒定范圍;菌懸液不乳化;沖液時氣泡過多等。除以上原因外，還有一些不能確定的因素也可導(dǎo)致不能有效鑒定。這說明VITEK儀器受外界干擾的因素較多，因此其使用受到一定的限制。

2 綠膿桿菌的分子生物學(xué)檢測方法的發(fā)展

2.1 常規(guī)PCR

PCR是從極微量模板DNA產(chǎn)生微克量DNA的一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡單的方法。尤其適合應(yīng)用于培養(yǎng)較困難或血清學(xué)方法不易檢測的病原微生物，以及在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中時間要求緊迫的微生物檢測工作。目前常規(guī)PCR用到的靶基因有algD，oprL，ETA，16S rDNA等，主要是應(yīng)用于食品微生物的診斷和食源性疾病的鑒定。文獻(xiàn)報道Luiz等人［4］用algD基因為靶基因檢測綠膿桿菌，用于臨床上檢測囊腫性纖維化痰樣;Jiru Xu等［5］通過對靶基因oprL和ETA基因的研究，發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌的PCR檢測選用oprL基因要比ETA基因更敏感;Theodore Spilker等［6］為了在親緣性相近的假單胞菌屬之間做到更好地識別，用16S rDNA來設(shè)計引物。通過國外的報道還可以看出，國外對于綠膿桿菌的檢測主要是用于臨床上囊腫性纖維化患者病情的監(jiān)測［7］。PCR檢測方法的敏感性高于細(xì)胞培養(yǎng)法，然而細(xì)胞培養(yǎng)法的檢測特異性則高于PCR法。這是因為普通PCR引物單一，無法滿足微生物種屬鑒定上所需的特異性。而且該方法在瓊脂糖凝膠電泳過程中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離的效果有時不理想，實驗后有時會出現(xiàn)交叉污染的情況，均會導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

2.2 多重PCR

多重PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)的一種延伸，它的擴(kuò)增體系中需要含有多對引物，可同時完成多個目的片段的擴(kuò)增，達(dá)到同時檢測多種致病菌或者病原菌分型的目的。Daniel等［8］利用oprL與oprI兩基因，在兩基因同時擴(kuò)增檢測具有同步放大行的基礎(chǔ)上，區(qū)分熒光假單胞菌和綠膿桿菌。多重PCR檢測結(jié)果產(chǎn)生影響的關(guān)鍵因素之一是引物的設(shè)計，要求所有設(shè)計引物的退火溫度必須十分接近，擴(kuò)增產(chǎn)物大小的差別也要夠大以能夠?qū)⑵湓诃傊悄z電泳中區(qū)分開來。韓國學(xué)者Eui-Suk Jeong等［9］利用一段綠膿桿菌的高保守基因組片段設(shè)計引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長達(dá)726bp，與肝螺桿菌和沙門桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物明顯區(qū)分開來。同時，多重PCR的各引物擴(kuò)增之間也不能產(chǎn)生干擾，這在引物對數(shù)量多的反應(yīng)體系中十分重要。為了解決擴(kuò)增之間的競爭問題，也有研究建議在多重PCR引物兩端加上接頭［10］。有研究顯示目前正開發(fā)出一種通用引物，這樣就可以完成多種菌的同時高效檢出。

2.3 PCR－DHPLC

PCR結(jié)合了變性高效液相色譜技術(shù)(PCRDHPLC)是最近幾年來發(fā)展起來的一種靈敏、快速、準(zhǔn)確的基因檢測技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因診斷、突變檢測、分型鑒別等檢測中。曹際娟等［11］報道了采用PCR-DHPLC技術(shù)，以綠膿桿菌外毒素A(ETA)基因作為靶基因研究綠膿桿菌檢測的新方法，該方法采用高壓閉合液相流路，將DNA樣品自動注入并與緩沖液一起流過DNA分離柱，通過緩沖液不同的梯度變化，在不同溫度條件下，由熒光系統(tǒng)檢測已被分離的DNA樣品，來實現(xiàn)對DNA不同的分析。該技術(shù)目的是更快速、更準(zhǔn)確、高靈敏度、高通量地檢測食品、化妝品、臨床樣本及環(huán)境樣本中的綠膿桿菌。

2.4 Real－time PCR

實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，無疑給PCR檢測領(lǐng)域又注入了新的活力，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR由定性到定量的飛躍，而且與普通PCR相比，它結(jié)合了PCR技術(shù)的高靈敏度和核酸雜交技術(shù)的特異性。它的特異性更強(qiáng)、能有效解決PCR污染問題、自動化程度更高，目前在國內(nèi)外廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因方面研究、病原體檢測等領(lǐng)域［12］。Real-time PCR技術(shù)，它是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記了兩個熒光素標(biāo)記的探針。一個是探針5＇端的熒光報告基團(tuán)(R);另一個是3＇端的熒光淬滅基團(tuán)(Q)。探針完整或位置很近時，報告基因發(fā)射的熒光被淬滅熒光基團(tuán)吸收，當(dāng)PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5＇-3＇外切酶將探針上的熒光基團(tuán)酶切降解，使兩基團(tuán)分離，抑制作用消失，從而使報告基團(tuán)熒光信號被檢測到。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子發(fā)熒光，通過熒光信號的累積來實現(xiàn)與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

國內(nèi)在相關(guān)領(lǐng)域的研究較少，但是也有了初步的進(jìn)展。如薛利軍等［13］用特異性引物擴(kuò)增16S rDNA靶片段，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒將梯度稀釋質(zhì)粒作為模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以SYBR Green I作為熒光染料對不同濃度的綠膿桿菌DNA樣品進(jìn)行Real-time PCR檢測，該體系可在2h內(nèi)完成檢測，同時顯示了良好的特異性和靈敏度，可以用于醫(yī)院細(xì)菌感染的鑒定。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)16S rDNA作為靶基因的檢測假陽性率稍高，而且以SYBR Green I作為熒光染料的特異性較低。肖興龍等［14］，以ETA作為靶基因設(shè)計特異性引物及TaqMan探針，建立Real-time PCR檢測綠膿桿菌的方法，由于用到特異性探針，以及ETA的高度保守性，該體系與當(dāng)時的檢測方法相比有著更高的靈敏度和特異性。

相比之下，國外在相關(guān)領(lǐng)域的研究則更為成熟，尤其是近幾年對于囊腫性纖維化患者臨床檢測的研究，無論是從靶基因的選取，還是DNA的提取，以及多種方法綜合比對分析從而選出最優(yōu)，都更加系統(tǒng)，并日趨完善。鑒于標(biāo)準(zhǔn)表型鑒定方法費時及其局限性，以及選用16S rDNA、algD、oprI、ETA、gyrB 等靶基因都有一定的假陽性結(jié)果出現(xiàn)，Vincent等［15］選用ecfX作為靶基因，檢測結(jié)果的特異性和陽性預(yù)測值均達(dá)到100%。oprL基因由于比ETA靈敏，假陽性率低，較適合用于早期囊腫性纖維化患者痰樣中綠膿桿菌的檢測。Pieter等［16］先是利用oprL基因比較培養(yǎng)法、常規(guī)PCR以及Real-time PCR方法檢測綠膿桿菌的靈敏度，并優(yōu)化了DNA提取方案，比較結(jié)果顯示以探針為基礎(chǔ)的Real-time PCR方法可以達(dá)到培養(yǎng)法的檢測結(jié)果，并且檢測迅速，能夠及時發(fā)現(xiàn)早期感染。Pieter等［17］的研究有一部分培養(yǎng)鑒定陰性、Real-time PCR鑒定陽性的樣本，在后續(xù)觀測時間里培養(yǎng)鑒定又轉(zhuǎn)為陽性，這說明以oprL為靶基因的Real-time PCR檢測對于綠膿桿菌在預(yù)測感染方面有著重要的臨床價值。

表1 綠膿桿菌各種檢測技術(shù)的比較Table 1 Comparison of various detection techniques of Pseudomonas aeruginosa

2.5 基因芯片

基因芯片又稱DNA芯片、DNA微陣列，是一種新的基因檢測方法，是自上世紀(jì)90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的一項科技進(jìn)展，是基礎(chǔ)研究可靠并有效的工具。其在致病菌檢測領(lǐng)域有著前所未有的優(yōu)勢:它具有PCR的高靈敏度與分子雜交的高特異性的雙重優(yōu)勢，顯著提高了檢測的靈敏度和特異性;它能對同一致病菌進(jìn)行多基因位點檢測，避免了單一位點檢測的缺陷，大大降低假陽性，顯著提高信噪比;它能同時對多種致病菌進(jìn)行檢測，降低單項檢測成本;此外，它還自帶質(zhì)控體系，可以檢測和消除系統(tǒng)誤差。將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于綠膿桿菌鑒定方面，將大大提高菌株的陽性檢出率，縮短檢驗時間，具有重要的現(xiàn)實意義。瞿良等［18］采用PCR擴(kuò)增制備綠膿桿菌的靶基因并進(jìn)行純化，對由昆明云大生化科技有限責(zé)任公司制做的基因芯片進(jìn)行雜交、洗脫、掃描檢測。結(jié)果表明，本研究中的基因芯片靈敏度和特異性都比較高，構(gòu)建的綠膿桿菌基因芯片與標(biāo)記的探針雜交效果好。說明基因芯片在綠膿桿菌檢測方面可靠性很高。

3 比較與討論

根據(jù)對上述各項技術(shù)的介紹可以看出，現(xiàn)有的綠膿桿菌檢測技術(shù)都各自表現(xiàn)出很多優(yōu)點，但也分別存在著不足。表1中對上述綠膿桿菌的檢測技術(shù)進(jìn)行了比較。

通過本文的簡單介紹及表1可以看出，應(yīng)用VITEK法可減少工作量，提高工作效率，但檢測結(jié)果仍然易受各種因素的影響;分子生物學(xué)技術(shù)靈敏度高，檢測時間短，突破了傳統(tǒng)檢測方法的局限性，但自身也存在有待提高之處。如常規(guī)PCR雖靈敏度特異性都很高，但結(jié)果仍有一定的假陽性檢出率;多重PCR引物擴(kuò)增會有相互干擾的現(xiàn)象;PCR-DHPLC除存在“柱外效應(yīng)”以外，它的靈敏度還有待進(jìn)一步的提高。這些不足還需要國內(nèi)外研究者不斷地完善和改進(jìn)。

此外，分子生物學(xué)檢測的各項技術(shù)綠膿桿菌運用到了不同的靶基因，通過文獻(xiàn)介紹發(fā)現(xiàn)不同的靶基因中也存在著相應(yīng)的優(yōu)點與不足，下面就綠膿桿菌檢測所涉及到的各個靶基因進(jìn)行比較，如表2。比較可以看出，靶基因的選擇對于檢測結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性不同，所以在實際工作中，需要根據(jù)對檢測結(jié)果的要求選擇不同的檢測方法和靶基因。

表2 檢測綠膿桿菌所選靶基因的比較Table 2 Comparison of different target genes for detection of Pseudomonas aeruginosa

4 結(jié)論與展望

目前國內(nèi)的綠膿桿菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)正在逐步興起，準(zhǔn)確、靈敏、快速的分子生物學(xué)檢測技術(shù)正在顯現(xiàn)它巨大的潛力與優(yōu)勢。尤其是實時熒光定量PCR技術(shù)，相比其他分子生物學(xué)檢測技術(shù)，檢測技術(shù)更加成熟，檢測結(jié)果更加高效。由于SYBR Green Real-time PCR體系的成本低，起初國內(nèi)研究者構(gòu)建以SYBR Green為熒光染料的檢測體系，雖然與常規(guī)PCR相比有著更高的靈敏度和特異性，但作為雙鏈DNA結(jié)合染料，SYBR Green法產(chǎn)生的假陽性結(jié)果偏高。因此，需要建立特異性更高的TaqMan探針Real-time PCR檢測體系。通過國內(nèi)外研究比對，oprL、ETA、ecfX等均為檢測綠膿桿菌所需較為理想的靶基因，可以作為后續(xù)建立體系的篩選備用靶基因。此外，多重PCR技術(shù)在同時檢測多種致病菌方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性，若將其與Real-time PCR相結(jié)合，不失為高效檢測綠膿桿菌以及其他致病菌的另一途徑。

當(dāng)然，各種方法的結(jié)果其意義是不同的，傳統(tǒng)的病原培養(yǎng)、分離、鑒定與檢測技術(shù)雖然耗時長、檢出敏感性差，但不論在疾病的診斷還是衛(wèi)生學(xué)評價中仍是不可缺少的金標(biāo)準(zhǔn)，也是分子生物學(xué)技術(shù)所不能取代的。我們要將傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)方法作為基礎(chǔ)，與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合相并行，才能得出最準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，才能實現(xiàn)最終的檢測目標(biāo)。

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Research advances in molecular detection of Pseudomonas aeruginosa

ZHANG Xin-yue1，ZHANG Xiu-jun1，*，HE Cong-fen2，GAO Lu2
(1.College of Life Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China;2.College of science，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

TS201.2

A

1002-0306(2012)12-0401-05

2011-06-28 *通訊聯(lián)系人

張昕悅(1987-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:病原生物學(xué)。