李 曦，尤 歡，楊嚴(yán)俊

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

雞胚蛋提取物對(duì)體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響

李 曦，尤 歡，楊嚴(yán)俊*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

目的:以體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究雞胚蛋提取物對(duì)免疫力低下小鼠脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響。方法:以水和石油醚為提取介質(zhì)，檢測(cè)雞胚水溶物(CEAE)和脂溶物(CEPEE)在10～500μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖、脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、巨噬細(xì)胞吞噬作用以及巨噬細(xì)胞產(chǎn)NO的影響。結(jié)果:雞胚蛋提取物能恢復(fù)免疫低下小鼠的免疫功能，CEPEE顯著地促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖并分泌IL-2，而CEAE則對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和分泌NO能力顯示出更強(qiáng)的刺激作用，兩種提取物均呈現(xiàn)出量效關(guān)系。結(jié)論:雞胚蛋脂溶物和水溶物分別作用于淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用。

雞胚蛋，免疫力低下，脾淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

Abstract:Objective:To study the effect of embryonated egg extracts on splenocyte and macrophage of hypoimmunity mice by in vitro cell trials.Methods:Hydro-ligarine was applied as the extraction solvent to divide embryonated egg mixture to hydro-soluble(CEAE)and petroleum-ether-soluble(CEPEE)part.The investigation of immunomodulatory effect of CEAE and CEPEE consisted of splenocyte proliferation，IL-2 production，macrophage phagocytosis and NO production at concentration of 10～ 500μg/mL.Results:Embryonated egg extracts recovered the the immune function.CEPEE remarkably enhanced splenocyte proliferation and IL-2 production，while CEAE significantly contributed to the macrophage function(macrophage phagocytosis and NO production)，both in a dose-dependent way.Conclusion:The hydro-soluble and petroleum-ether-soluble parts acted on the splenocyte and macrophage respectively to up-regulate cell immunity.

Key words:embryonated egg;hypoimmunity;splenocyte;macrophage;cell experiment

在我國(guó)南方及東南亞一帶素有食用雞胚蛋以滋補(bǔ)身體的習(xí)俗，據(jù)稱有健脾胃、補(bǔ)腎健體之功效?，F(xiàn)代研究證明，雞胚蛋中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物(葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、呋喃糖等)、脂類(蛋黃卵磷脂等)、脂肪酸(亞油酸等)及常量和微量元素(Ca，Cu，Zn 等)、維生素(A，B，C，E)［1］等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有學(xué)者以小鼠體內(nèi)灌服實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雞胚勻漿混懸液能提高小鼠脾臟指數(shù)、促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)溶血素活性和巨噬細(xì)胞吞噬能力以及延長(zhǎng)小鼠力竭致死游泳時(shí)間［2-4］，對(duì)小鼠的免疫功能具有顯著的正向調(diào)節(jié)作用。機(jī)體免疫是由免疫器官和組織、免疫細(xì)胞和免疫分子組成的一個(gè)復(fù)雜的功能整體。前人對(duì)雞胚蛋免疫調(diào)節(jié)作用的研究多基于雞胚勻漿物的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，本文以水和石油醚為介質(zhì)分離提取雞胚蛋的免疫調(diào)節(jié)成分，得到雞胚蛋脂溶物(CEPEE)和雞胚水溶物(CEAE)，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)比較二者對(duì)脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用效果。從免疫細(xì)胞和免疫分子水平上初步探索雞胚蛋發(fā)揮免疫功效的機(jī)理，為雞胚蛋這一生物資源在保健食品中的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胚蛋 12d，安徽榮達(dá)生物科技有限公司;RPMI 1640、小牛血清、MTT、青鏈霉素溶液、臺(tái)盼藍(lán)、ConA、L-谷氨酰胺、0.2μm過(guò)濾器 均購(gòu)自上海生工;IL-2 ELISA試劑盒 美國(guó)RD公司;注射用環(huán)磷酰胺Cy 江蘇恒瑞醫(yī)藥公司;其余試劑均為分析純;完全培養(yǎng)基 RPMI 1640添加5%小牛血清、1%青鏈霉素、1%L-谷氨酰胺配制而成;細(xì)胞裂解液 甲醇+0.01%醋酸溶液(1∶1);格里斯試劑 1%對(duì)氨基苯磺酸，0.1%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，2.5%磷酸;環(huán)磷酰胺注射液 滅菌生理鹽水配制成80mg/kg終濃度注射液;清潔級(jí)昆明種雄鼠 上海斯萊克，6～8周齡，(20±2)g，造模小鼠細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前3d，每日腹腔注射0.25mL環(huán)磷酰胺注射液，建立免疫力低下小鼠模型。

DS-1型組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;冷凍干燥機(jī) Labconco;23R型高速冷凍離心機(jī) HealForce-Neofuge;倒置顯微鏡 奧林巴斯;MK3型酶標(biāo)儀 Thermo-Multiskan;370型CO2培養(yǎng)箱 Thermo-Forma;IKA-RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物的制備 12d雞胚蛋組織搗碎、凍干后儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。

以胃蛋白酶、胰酶先后水解雞胚凍干物(模擬體內(nèi)消化過(guò)程)。加入與水體積等量的石油醚，磁力攪拌8h。8000r/min高速離心10min使混懸液分層，分液漏斗分別收集水溶部分和脂溶部分，水溶部分直接凍干得到雞胚水溶物CEAE，脂溶部分40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚，凍干，得到雞胚脂溶物CEPEE。用完全培養(yǎng)基將兩種提取物分別溶解成1mg/mL的母液，0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，隨后再用完全培養(yǎng)基稀釋成以下五個(gè)濃度梯度:500、250、100、50 和10μg/mL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為以下13組:正常對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)、模型對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照組(終濃度為5μg/mL的ConA)、5個(gè)濃度梯度的CEAE和5個(gè)濃度梯度的CEPEE。鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí)，除正常對(duì)照組給予正常小鼠細(xì)胞，其余各組均給予免疫力低下造模小鼠細(xì)胞。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌取脾，制備脾淋巴細(xì)胞懸浮液［5］。臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞，存活率為95%。完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106cells/mL鋪板，向96孔板中加入脾細(xì)胞懸液100μL/well，37℃、5% 的 CO2培養(yǎng)箱適應(yīng)性培養(yǎng)4h。4h后，按1.2.2實(shí)驗(yàn)分組每孔加入100μL的樣品，共13組，每組5個(gè)復(fù)孔。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，MTT法測(cè)定脾細(xì)胞增殖效果［6］。

1.3.2 脾臟細(xì)胞分泌IL-2水平 按1.3.1方法制備5×106cells/mL的脾淋巴細(xì)胞懸液，100μL/well鋪96孔板，再按1.2.2實(shí)驗(yàn)分組加入100μL的樣品。因脾淋巴細(xì)胞體外分泌IL-2活性低，每孔需同時(shí)再加入終濃度5μg/mL的有絲分裂原ConA。培養(yǎng)48h后，離心收集上清液，-20℃保存，即為 IL-2待測(cè)樣品［7］。采用ELISA法，按照試劑盒指示的操作建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定小鼠血清IL-2含量。

1.3.3 巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn) 小鼠脫頸致死，無(wú)菌取腹腔巨噬細(xì)胞［8］。計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率95%，完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106cells/mL鋪板，向96孔板中加入巨噬細(xì)胞 100μL/well，37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h后，PBS洗板2次除去未貼壁細(xì)胞。按1.2.2實(shí)驗(yàn)分組每孔加入200μL的樣品，每組五個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后進(jìn)行中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)儀測(cè) 540nm 吸光值［9］。

1.3.4 巨噬細(xì)胞NO釋放量的測(cè)定 取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 1 ×106cells/mL 鋪板，100μL/well，37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h，PBS洗板2次除去未貼壁細(xì)胞。按1.2.2實(shí)驗(yàn)分組每孔加入200μL的樣品，每組五個(gè)復(fù)孔。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，收集上清液100μL/well，加入格里斯試劑，室溫放置10min后于550nm下測(cè)吸光值。以NaNO2做標(biāo)準(zhǔn)曲線定量［10-11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖1顯示小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺造模后，其脾臟細(xì)胞增殖率明顯下降(p＜0.05)，說(shuō)明環(huán)磷酰胺成功地建立了小鼠免疫力低下的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。而在給予雞胚提取物共同培養(yǎng)48h后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞得到刺激性增殖，高濃度的提取物(500、250μg/mL的CEAE和CEPEE)能使免疫低下小鼠的脾臟細(xì)胞增殖能力恢復(fù)到正常小鼠的水平?？傮w而言，兩種提取物的免疫刺激效果都隨著劑量的增加而增強(qiáng)，500μg/mL的CEPEE對(duì)免疫力低下小鼠脾細(xì)胞的增殖率達(dá)到78%，超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照物5μg/mL ConA的刺激效果。相較水溶性成分，脂溶性成分對(duì)免疫力低下小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞增殖顯示出更強(qiáng)的刺激效果。

圖1 雞胚提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of embryonated egg extracts on splenocyte proliferation

2.2 雞胚提取物對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL－2的影響

小鼠注射環(huán)磷酰胺之后，淋巴細(xì)胞分泌的IL-2含量顯著降低(p＜0.01)。而在終濃度為10μg/mL陽(yáng)性對(duì)照物ConA的刺激下，IL-2含量顯著回升，恢復(fù)到正常脾臟淋巴細(xì)胞水平。除了10μg/mL的低濃度提取物，50～500μg/mL的雞胚提取物均對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2顯示出刺激作用，其中500μg/mL和250μg/mL CEPEE均能恢復(fù)IL-2含量至正常小鼠水平(p＜0.01)。同時(shí)，500μg/mL CEAE也顯示出較強(qiáng)的刺激作用(p＜0.05)。與脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在50～500μg/mL范圍內(nèi)，同濃度的脂溶物均顯示出比水溶物更強(qiáng)的刺激脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的作用。

圖2 雞胚提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響Fig.2 Effect of embryonated egg extracts on splenocyte IL-2 secretion

2.3 雞胚提取物對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

如圖3所示，相較正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，模型對(duì)照組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率明顯下降。而在給予雞胚提取物共同培養(yǎng)24h后，兩種提取物均能使免疫抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力恢復(fù)到正常水平，高濃度的CEAE顯示出較強(qiáng)的促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的效果。不同于脾淋巴細(xì)胞增殖和分泌IL-2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，水溶物對(duì)巨噬細(xì)胞顯示出比脂溶物更強(qiáng)的刺激作用，并且這種效果呈劑量依賴關(guān)系，500μg/mL雞胚水溶物顯示出比陽(yáng)性對(duì)照物更強(qiáng)的刺激效果。

圖3 雞胚提取物對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.3 Effect of embryonated egg extracts on macrophage phagocytosis

2.4 雞胚提取物對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)NO的影響

如圖4所示，有絲分裂原ConA(陽(yáng)性對(duì)照)極顯著地促進(jìn)了免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫活性分子NO(p＜0.001)。CEAE也可刺激巨噬細(xì)胞分泌NO，并且隨著劑量的增加呈現(xiàn)出更強(qiáng)的刺激作用，在10～500μg/mL范圍內(nèi)顯示出量效依賴性。相較CEAE，CEPEE對(duì)免疫力低下小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的影響不大。

圖4 雞胚提取物對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO的影響Fig.4 Effect of embryonated egg extracts on NO production of macrophages

3 討論

淋巴細(xì)胞是機(jī)體最主要的免疫細(xì)胞，檢測(cè)藥物對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響是反映其免疫效果最直接的指標(biāo)。脾臟擁有全身循環(huán)T淋巴細(xì)胞的25%，IL-2是T淋巴細(xì)胞的自分泌或旁分泌生長(zhǎng)因子，IL-2是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的核心物質(zhì)，其生物學(xué)作用以刺激T細(xì)胞增生和誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖活化為主，除此之外還有其他重要功能如刺激NK細(xì)胞、CTL、LAK細(xì)胞的活化和增殖，也能促使T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素、腫瘤壞死因子等［12］。本實(shí)驗(yàn)的研究顯示:雞胚提取物能夠有效地提高免疫力低下小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖率并促進(jìn)其分泌IL-2，并且在10～500μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效果，并能夠恢復(fù)體外培養(yǎng)的免疫力低下小鼠脾淋巴細(xì)胞的非特異性免疫功能到正常水平。

除了發(fā)揮核心免疫功能的淋巴細(xì)胞之外，巨噬細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫的貢獻(xiàn)也不容忽視。巨噬細(xì)胞是機(jī)體早期抗感染的主要細(xì)胞，其吞噬功能是免疫系統(tǒng)維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段。除此之外，巨噬細(xì)胞還分泌NO，是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的重要防御分子，具有抗炎抗菌的作用，是巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，參與抵抗細(xì)菌、真菌及細(xì)胞內(nèi)原蟲和蠕蟲等感染的炎癥反應(yīng)的重要因子［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:雞胚水溶物顯著地促進(jìn)了免疫力低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，刺激免疫分子NO的產(chǎn)生，并且呈現(xiàn)量效關(guān)系;而脂溶物對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激作用不顯著。

4 結(jié)論

雞胚提取物能夠恢復(fù)體外培養(yǎng)的免疫力低下小鼠的脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫功能，并且該作用隨著提取物濃度的增加而增強(qiáng)。其中，雞胚脂溶物主要作用于淋巴細(xì)胞，而雞胚水提物則能刺激巨噬細(xì)胞的免疫功能。它們作用于免疫細(xì)胞的差異性初步顯示出雞胚蛋免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制，這也為雞胚免疫活性成分的篩選奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Effect of embryonated egg extracts on splenocyte and macrophage in vitro

LI Xi，YOU Huan，YANG Yan-jun*
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

TS201.4

A

1002-0306(2012)12-0368-03

2011-10-19 *通訊聯(lián)系人

李曦(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。