趙慶生，孫 健，肖 杰，趙 兵，黃云祥

(1.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049;3.秦皇島長(zhǎng)勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，河北秦皇島066000)

蘆筍葉綠素銅鈉鹽制備過(guò)程中提取工藝的研究

趙慶生1，2，孫 健1，2，肖 杰1，2，趙 兵1，*，黃云祥3

(1.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049;3.秦皇島長(zhǎng)勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，河北秦皇島066000)

采用超聲法對(duì)蘆筍葉進(jìn)行了葉綠素的提取并合成了葉綠素銅鈉鹽。結(jié)果表明，蘆筍葉綠素的最佳提取工藝條件為:提取溶劑為80%丙酮與95%乙醇體積比1∶4，提取時(shí)間60min，提取溫度70℃，液固比10∶1，超聲功率160W。提取的葉綠素溶液，經(jīng)過(guò)皂化、酸化、銅代、成鹽等步驟制成葉綠素銅鈉鹽，得率(以鮮葉計(jì))為0.18%，產(chǎn)品質(zhì)量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 3262-1982。

蘆筍，葉綠素，葉綠素銅鈉鹽

Abstract:The extraction process of chlorophyll and the preparation of sodium copper chlorophyllin from leaves of Asparagus officinalis were studied.The results showed that the extraction solvent was 80%acetone and 95%ethanol with the ratio of 1∶4，the ratio of liquid to solid was 10∶1，the extraction temperature was 70℃，the extracting time was 60min and ultrasonic power was 160W.Then sodium copper chlorophyllin was made by chemical progressing and the yield was 0.18%.The quality of sodium copper cholorphyllin met the national standard GB 3262-1982.

Key words:Asparagus officinalis;chlorophyll;sodium copper chlorophyllin

葉綠素(Chlorophyll)是一種天然、安全、無(wú)毒并具有一定生理功能的脂溶性天然色素。它可以作為食品、化妝品的著色劑，也可以用于醫(yī)藥領(lǐng)域［1］。天然葉綠素性質(zhì)極不穩(wěn)定，在酸、光照、氧氣、溫度及微生物的作用下，極易降解、破壞和褪色，因而限制了其應(yīng)用。葉綠素中鎂離子被銅離子取代后制成的葉綠素銅鈉鹽(Sodium copper chlorophyllin，SCC)，不僅保持了葉綠素鮮艷的色澤，增強(qiáng)了穩(wěn)定性，而且具有與葉綠素類似的生理功能，并改善了葉綠素的水溶性。研究發(fā)現(xiàn) SCC 不僅具有抗誘變［2］、抗氧化［3］等活性，而且具有改善肝功能、促進(jìn)造血等療效。SCC除了作為食品添加劑、日化工業(yè)添加劑［4］應(yīng)用之外，還被用做治療急、慢性肝炎［5］，及白細(xì)胞減少癥［6］藥物的原料。因此，葉綠素銅鈉鹽的市場(chǎng)前景十分廣闊。蘆筍(Asparagus officinalis L.)，學(xué)名石刁柏，又名龍須菜，是百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物。蘆筍因其質(zhì)地鮮嫩、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富［7］，在國(guó)際上享有“蔬菜之王”的美稱。目前，我國(guó)蘆筍種植面積達(dá)到170萬(wàn)畝，年產(chǎn)137.6萬(wàn)t，居世界第一位。蘆筍在采收蘆筍后殘留的枝葉被當(dāng)作廢棄物，沒(méi)有得到充分的利用，若將蘆筍枝葉中的葉綠素充分利用，既能提高蘆筍產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)附加值、增加農(nóng)民收入，也能變廢為寶、改善環(huán)境，具有一定的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆筍葉(鮮) 由秦皇島長(zhǎng)勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供;乙醇、丙酮、石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅等 均為分析純。

KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗儀，2802UV/VIS分光光度計(jì)，DGG-9140A pH計(jì)，Re-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，DK-8P型電熱恒溫水槽，DZ-1BC真空干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠素的測(cè)定 利用葉綠素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收性能，根據(jù)朗伯-比爾定律及吸光度的加和性原理，在663和645nm處測(cè)定葉綠素提取液的吸光度，并計(jì)算葉綠素提取率［8］:

式中:A645、A663分別為葉綠素提取液在 645、663nm處的吸光度;V為提取液的體積，L;n為稀釋倍數(shù);m為蘆筍葉的質(zhì)量，mg。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的蘆筍葉，粉碎后加入一定量的提取溶劑，在超聲波條件下提取葉綠素，然后抽濾，收集濾液，將濾液稀釋一定倍數(shù)，進(jìn)行吸光度檢測(cè)。全部實(shí)驗(yàn)在避光或弱光條件下進(jìn)行。

提取過(guò)程分別考察提取溶劑、超聲功率、提取時(shí)間、液固比和提取溫度對(duì)葉綠素提取率的影響。

1.2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溶劑、超聲提取時(shí)間、提取溫度、液固比和超聲功率因素作為考察對(duì)象，以葉綠素提取率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化，以獲取最優(yōu)提取工藝參數(shù)。正交實(shí)驗(yàn)各因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal assay design

1.2.4 葉綠素銅鈉鹽的制備［9］以下實(shí)驗(yàn)均在避光或弱光條件下進(jìn)行。a.皂化:向葉綠素浸提液中加入5%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至11，60℃水浴加熱60min進(jìn)行皂化反應(yīng)。b.濃縮:將皂化液減壓濃縮至原體積的1/5。c.萃取:向濃縮液中加入石油醚，反復(fù)萃取未皂化的葉黃素、胡蘿卜素等脂溶性雜質(zhì)。d.酸化:向萃余相滴加6mol/L鹽酸，調(diào)節(jié)pH為2～3，于60℃水浴酸化30min。e.銅代:酸化后，緩慢加入20%硫酸銅溶液，70℃條件下攪拌120min，生成墨綠色細(xì)小疏松的葉綠素銅酸，用蒸餾水洗滌并抽濾至濾液呈無(wú)色，烘干。f.成鹽:將葉綠素銅酸用丙酮溶解，加入5%的氫氧化鈉-乙醇溶液調(diào)節(jié)pH為12，室溫?cái)嚢?0min，靜置，有墨綠色的葉綠素銅鈉沉淀生成，抽濾干燥，得產(chǎn)品。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑對(duì)葉綠素提取效果的影響

葉綠體中含有綠色素和黃色素兩大類，純的有機(jī)溶劑不能打破葉綠體色素與蛋白質(zhì)的結(jié)合，所以必須用能與水混溶的有機(jī)溶劑，才能將葉綠體色素提取出來(lái)。一般采用的提取溶劑為80%丙酮或95%乙醇，因此，本研究采用二者混合作為葉綠素的提取溶劑，液固比10∶1，超聲功率100W，常溫條件下提取60min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖1可知，80%丙酮與95%乙醇體積比為1∶4(X∶Y=2∶8)時(shí)，蘆筍葉綠素提取率最高，因此適宜采用兩種溶劑混合的方式作為蘆筍葉綠素提取的溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction yield of chlorophyll

2.2 超聲功率對(duì)葉綠素提取效果的影響

超聲波的功率反映了提取過(guò)程的超聲強(qiáng)度，一般功率越大提取效果越好，但過(guò)大的超聲功率會(huì)使得目標(biāo)產(chǎn)物的溶出也較多，另外對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的破壞作用也越大。采用80%丙酮∶95%乙醇=1∶4作為提取劑，液固比10∶1，提取時(shí)間60min，常溫條件下考察超聲功率對(duì)蘆筍葉綠素提取率的影響，結(jié)果如圖2所示，超聲功率在140W的條件下最適合蘆筍葉綠素的提取。研究過(guò)程發(fā)現(xiàn)，超聲功率過(guò)大，葉綠素提取液迅速由綠色變?yōu)辄S褐色，葉綠素遭到超聲波的嚴(yán)重破壞，因此在提取過(guò)程中應(yīng)注意超聲波的影響。

圖2 超聲功率對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of chlorophylls

2.3 提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取效果的影響

超聲的時(shí)間越長(zhǎng)，就會(huì)越有利于目標(biāo)產(chǎn)物從原料中釋放到提取溶劑體系中。為考察提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取的影響，采用80%丙酮∶95%乙醇=1∶4作為提取劑，液固比10∶1，超聲功率140W，常溫條件下考察提取時(shí)間對(duì)蘆筍葉綠素提取率的影響，結(jié)果如圖3所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素提取率顯著提高，80min之后葉綠素提取率增加不顯著。

2.4 提取液固比對(duì)葉綠素提取效果的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of chlorophylls

液固比是影響物料中目標(biāo)產(chǎn)物向溶劑中擴(kuò)散的一個(gè)關(guān)鍵性因素。液固比增大，加大了傳質(zhì)動(dòng)力，從而促進(jìn)更多的目標(biāo)產(chǎn)物向溶劑中擴(kuò)散。但液固比的增加引入了更多的提取溶劑，使得后續(xù)處理的難度增加。為研究液固比對(duì)葉綠素提取的影響，采用80%丙酮∶95%乙醇 =1∶4作為提取劑，提取時(shí)間80min，超聲功率140W，常溫條件下，考察了不同的液固比條件下蘆筍葉綠素的提取率。不同液固比對(duì)蘆筍葉綠素提取率的影響如圖4所示，由圖4可知，隨著液固比的增加，葉綠素提取率先升高后降低，液固比在8∶1條件下最適合蘆筍葉綠素的提取。

圖4 液固比對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.4 Effect of the ratio of liquid to solid on extraction yield of chlorophylls

2.5 提取溫度對(duì)葉綠素提取效果的影響

提取過(guò)程中溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)活躍，擴(kuò)散能力變強(qiáng)，有利于傳質(zhì)。但當(dāng)溫度太高時(shí)也會(huì)改變目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。此外溫度對(duì)超聲波產(chǎn)生的空化作用具有一定的影響，研究發(fā)現(xiàn)隨溫度的升高，空化作用增強(qiáng)，但當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，空化所產(chǎn)生的破碎效果便會(huì)變差。為考察溫度在葉綠素提取過(guò)程中的作用效果，進(jìn)行單因素考察實(shí)驗(yàn)。采用80%丙酮∶95%乙醇=1∶4作為提取劑，提取時(shí)間80min，超聲功率140W，液固比8∶1，考察溫度對(duì)蘆筍葉綠素提取率的影響，結(jié)果如圖5所示，隨著提取溫度從40℃增加到70℃，葉綠素提取率先增高后降低，60℃提取率最高，70℃葉綠素提取率最低，原因可能與葉綠素在高溫條件下被破壞有關(guān)。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化葉綠素的提取

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2可知，影響因素主次順序?yàn)?溶劑＞溫度＞功率＞時(shí)間＞液固比。最佳提取條件的組合為 A3B2C4D3E3，即 80% 丙酮∶95% 乙醇 =1∶4，時(shí)間60min，溫度 70℃，液固比 10∶1，超聲功率 160W，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件之下，蘆筍葉綠素提取率為0.287%，均高于正交實(shí)驗(yàn)表1其他組合的葉綠素提取率。

圖5 提取溫度對(duì)葉綠素提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction yield of chlorophylls

表2 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析Table 2 Orthogonal assay design matrix and experimental results

2.7 蘆筍葉綠素銅鈉鹽

制備所得SCC產(chǎn)品為墨綠色粉末，帶有金屬光澤，略溶于醇和氯仿，微溶于乙醚，易溶于水，在空氣中容易吸潮，水溶液為澄清亮綠色，得率(以鮮葉計(jì))為0.18%。制備的SCC全波長(zhǎng)掃描見(jiàn)圖6，在405nm及630nm處有最大吸收峰，與葉綠素銅鈉鹽的特征吸收峰相吻合。按照國(guó)標(biāo)方法對(duì)制備的葉綠素銅鈉鹽的其它質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，所有結(jié)果均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 3262-1982，見(jiàn)表3。

3 結(jié)論

研究表明，采用溶劑80%丙酮與95%乙醇體積比為1∶4時(shí)提取蘆筍葉綠素效果最佳。提取工藝條件為:提取時(shí)間60min，溫度 70℃，液固比 10∶1，超聲功率160W。葉綠素提取液加入5%氫氧化鈉溶液60℃皂化60min;濃縮、萃取除雜之后、6mol/L鹽酸酸化30min，20%硫酸銅溶液，70℃銅代120min;5%的氫氧化鈉-乙醇溶液室溫?cái)嚢?0min成鹽制備出葉綠素銅鈉鹽，產(chǎn)品質(zhì)量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

圖6 合成的葉綠素銅鈉鹽全波長(zhǎng)掃描圖Fig.6 Full wavelength scans of sodium copper chlorophyllin

表3 葉綠素銅鈉鹽主要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果Table 3 The national standard and experimental results of SCC

［1］關(guān)錦毅，郝再彬，張達(dá)，等.葉綠素提取與檢測(cè)及生物學(xué)功效的研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(12):130-134.

［2］Pimentel E，Cruces MP，Zimmering S.A study of the inhibition/promotion effects of sodium-copper chlorophyllin(SCC)-mediated mutagenesis in somatic cells of Drosophila［J］.Mutation Research，2011，722:52-55.

［3］Gomes BB，Barros SBM，Andrade-Wartha ERS，et al.Bioavailability of dietary sodium copper chlorophyllin and its effect on antioxidant defence parameters of Wistar rats［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2009，89:2003-2010.

［4］Hosikian A，Lim S，Halim R，et al.Chlorophyll extraction from microalgae:A review on the process engineering aspects ［J］.International Journal of Chemical Engineering，2010(10):1-11.

［5］祝蘭卿，沈念慈，許德余.銅葉綠酸鈉對(duì)急、慢性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1990，21(10):442-445.

［6］魏克民，王守軍，浦錦寶，等.肝血寶(葉綠素銅鈉鹽)治療白細(xì)胞減少癥985例臨床療效分析［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2009，16(1):64-65.

［7］葉春勇，林媚.蘆筍營(yíng)養(yǎng)成分分析研究［J］.中國(guó)果菜，2005(2):37-38.

［8］童洋，肖國(guó)民，潘曉梅.響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻中葉綠素的超聲提取工藝［J］.化工學(xué)報(bào)，2009，60(11):2813-2819.

［9］劉玲玲.仙人掌葉綠素的提取及葉綠素銅鈉鹽的制備工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(6):240-242.

Study on extraction process of chlorophyll and preparation of sodium copper chlorophyllin from Asparagus officinalis leaves

ZHAO Qing-sheng1，2，SUN Jian1，2，XIAO Jie1，2，ZHAO Bing1，*，HUANG Yun-xiang3
(1.National Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China;2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China;3.QinHuangdao Chang Sheng Agricultural Science ＆ Technology Development Co.，Ltd.，QinHuangdao 066000，China)

TS255.1

B

1002-0306(2012)12-0302-04

2011-11-28 *通訊聯(lián)系人

趙慶生(1982-)，男，博士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物提取與結(jié)構(gòu)修飾。