白鳳翎，曲玲童，張柏林，趙宏飛

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧錦州121013；2.北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京 100083）

大豆蛋白水解物促乳酸菌增殖發(fā)酵的研究

白鳳翎1，曲玲童1，張柏林2，趙宏飛2

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧錦州121013；2.北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京 100083）

應用小型生物發(fā)酵罐對乳酸菌增殖作用進行發(fā)酵研究，結(jié)果表明，12g/100mL脫脂乳中添加大豆蛋白水解物增殖復合劑對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌生長具有顯著的促進作用。添加酵母膏脫脂乳培養(yǎng)基的產(chǎn)酸量比脫脂乳增加1倍，添加增殖復合劑后為脫脂乳的3.12倍。添加增殖復合劑可使乳酸菌數(shù)量達到10個數(shù)量級，比脫脂乳培養(yǎng)基提高1～2個數(shù)量級。從累積添加堿量和單位加堿量兩項指標來看，脫脂乳培養(yǎng)基乳酸菌生長呈現(xiàn)緩慢上升曲線，添加酵母膏呈現(xiàn)三段波浪式曲線，添加增殖復合劑為陡峭的上升曲線。單純添加酵母膏不能支持乳酸菌連續(xù)生長，添加大豆蛋白水解物和酵母膏能夠使乳酸菌生長快速啟動，并維持一個較高生長水平，獲得較大的細胞量的同時也充分利用乳中蛋白質(zhì)。

大豆蛋白水解物，乳酸菌，發(fā)酵，增殖

Abstract：The fermentation tests of proliferation on lactic acid bacteria（LAB） was carried out in bioreactor，the results showed that growth of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus were significantly promoted in 12g/100mL skim milk supplemented with soy protein hydrolysates（SPH）.The acid production of LAB on nonfat milk supplemented with yeast extracts and multiplication complex were 2 and 3.12 times than that of control.Then the cell count of LAB reached to 10lg cycle on skim milk supplemented with multiplication complex，which increased 1.0～2.0lg cycle than control.The parameter of accumulate additional alkali volume and interval additional alkali volume showed that the growth curve of LAB on skim milk ascend slowly，and three waves trend as supplemented with yeast extract，and went up dramatically with addition of multiplication complex.The addition of yeast extract alone can not support the continual growth of LAB，however，the addition of yeast extract and protein hydrolytes together can accelerate it and made it to keep in a high growth level.Much more biomass of LAB on milk with multiplication complex would be obtained and the protein in milk would be utilized sufficiently.

Key words：soy protein hydrolysates；lactic acid bacteria；fermentation；proliferation

直投式（direct-vat-set，DVS）酸奶發(fā)酵劑具有無需中間繼代培養(yǎng)，使用方便快捷，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等特點，在發(fā)酵乳制品中廣泛應用，作為一類新型的商品化制劑，細胞數(shù)量是影響乳酸菌發(fā)酵性能的關(guān)鍵因素。乳是乳酸菌的天然棲息地和生長的良好培養(yǎng)基，其中短肽是乳酸菌生長的主要氮源[1]。由于乳酸菌具有很弱的蛋白水解能力，乳中酪蛋白形成短肽和氨基酸不能完全滿足乳酸菌高密度生長的需要[2]，因此，以乳為基質(zhì)制備直投式發(fā)酵劑一直受到細胞密度制約。利用蛋白水解物作為乳酸菌生長增殖劑添加到乳中，提高培養(yǎng)基中多肽和氨基酸含量，使乳酸菌在生長過程中縮短延遲期，延長對數(shù)期和穩(wěn)定期，大幅度提高細胞數(shù)量，從而通過廉價蛋白水解物促進乳酸菌增殖，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。本文在實驗室條件下應用小型生物發(fā)酵罐，研究大豆蛋白水解物增殖復合劑對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌生長的影響，探究大豆蛋白水解物對乳酸菌的增殖作用效果，為建立乳酸菌高密度細胞培養(yǎng)體系提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）S1菌株、德式乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus）L2菌株 北京林業(yè)大學食品發(fā)酵實驗室保存菌種。

12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基 臨用前配制，倒入發(fā)酵罐中，連同發(fā)酵罐115℃滅菌20min；大豆分離蛋白 含量為91.6%，山東禹王實業(yè)有限公司；6mol/L NH4OH 臨用前配制，115℃滅菌20min；酵母膏。

BIOTECH-3BG-5BG生物發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備有限公司。發(fā)酵罐以底盤加熱和循環(huán)水控制溫度，溫度控制在設(shè)定溫度±0.2℃，pH控制在設(shè)定pH±0.05，轉(zhuǎn)速控制在設(shè)定轉(zhuǎn)速±1r/min范圍內(nèi)。主要技術(shù)指標：玻璃罐體，3、5L；磁力攪拌速度，50～1000r/min；溫度控制，（冷卻水＋5～65℃）；消毒方式，整體滅菌鍋消毒。計算機全程監(jiān)控溫度、pH、溶解氧（DO）、轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐內(nèi)壓力等各項指標，全程記錄加堿、加酸、消泡和補料等情況。

1.2 實驗方法

S1菌株和L2菌株分別經(jīng)12g/100mL脫脂乳37℃培養(yǎng)后，在MRS瓊脂上分離，取單個典型菌落經(jīng)12g/100mL脫脂乳傳代3次，充分恢復菌株活力用作發(fā)酵實驗菌種。

大豆蛋白水解物是以5%大豆分離蛋白為基質(zhì)，經(jīng)90℃水浴中預熱15min，冷卻，調(diào)節(jié)pH至8.0。按4000U/g加入堿性蛋白酶，50℃水浴作用6h。在反應過程中，滴加2.0mol/L NaOH維持pH穩(wěn)定。反應結(jié)束后85℃加熱10min鈍化酶，離心取上清液[3]。經(jīng)Millipore Lab scale TFF System Kit超濾獲得小于5ku分子量的大豆蛋白水解物，經(jīng)測定其中多肽和氨基酸含量為3.02g/100mL。乳酸菌增殖復合劑為大豆蛋白水解物與酵母浸出物兩者按5∶1質(zhì)量比例臨用時混勻配制而成。

應用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌株分別在12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基、12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基添加0.5%酵母膏和12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基添加增殖復合劑三種條件下進行混合發(fā)酵的實驗研究。

1.2.1 溫度控制 嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌聯(lián)合生長具有典型生理學特征，相對而言，嗜熱鏈球菌比保加利亞乳桿菌具有較強的蛋白水解能力。在兩者混合生長過程中，早期嗜熱鏈球菌生長占優(yōu)勢地位，隨著乳酸的形成保加利亞乳桿菌逐漸取代嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢菌種，二者共同培養(yǎng)的最佳生長溫度為略高于40℃，溫度過高過低都會影響細菌的數(shù)量和發(fā)酵活力[4]。本實驗將溫度控制在（42±0.5）℃范圍內(nèi)。

1.2.2 pH控制 乳酸菌發(fā)酵乳中糖類形成乳酸pH從6.5左右逐漸下降到4.0左右，酸性環(huán)境對乳酸菌生長、生存產(chǎn)生不利的影響。在乳酸菌發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中，控制培養(yǎng)基的pH是獲得高密度、高活性的細胞的一種有效手段。吳榮榮[5]研究表明，將發(fā)酵乳的pH維持在5.90左右獲得乳酸菌細胞量最大，考慮生產(chǎn)發(fā)酵劑時培養(yǎng)基中存在較多的金屬離子可能對乳酸菌產(chǎn)生不利的影響，選用6mol/L NH4OH作為中和性試劑控制培養(yǎng)基的pH在5.90±0.05范圍內(nèi)。

1.2.3 轉(zhuǎn)速控制 工廠化生產(chǎn)發(fā)酵劑采用大型發(fā)酵罐，采用靜止培養(yǎng)方式不能有效傳遞物質(zhì)和熱能，會形成物質(zhì)梯度和溫度梯度，特別在pH調(diào)控時會產(chǎn)生酸度差異性。相反，攪拌會影響凝乳過程、抑制乳酸形成[6]，同時攪拌可使部分空氣進入培養(yǎng)基基質(zhì)中，形成微好氧環(huán)境，更有利于乳酸菌的生長[7]。攪拌速度過低達不到物質(zhì)和熱傳遞要求，過高使空氣進入過多會影響乳酸菌生長，一般選擇在100r/min比較適宜[8]。本實驗選擇轉(zhuǎn)速為85r/min，在細菌進入對數(shù)生長期后，隨著產(chǎn)酸量增加，滴加6mol/L NH4OH的量不斷加大，適當增加轉(zhuǎn)速至100r/min，然后回至85r/min。

滅菌前準確校正發(fā)酵罐pH電極，滅菌后取少量培養(yǎng)基用酸度計測定pH，兩者比較，確定pH的變化情況，調(diào)節(jié)pH。在接種口以酒精火焰下分別接種2.5%嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳培養(yǎng)物，設(shè)定溫度為42℃、pH為5.90、轉(zhuǎn)速為85r/min開始發(fā)酵實驗。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵動力學分析

1.2.4.1 發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)酸量變化分析 依據(jù)不同發(fā)酵階段的堿消耗量計算發(fā)酵過程中產(chǎn)酸量，由累積和單位時間（0.1h）滴加堿量間接推斷細菌生長量及生長速率。

式中：μX-比生長速率；dX-單位時間加堿量；dT-單位時間。

1.2.4.2 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量分析 分別在0、2、4、6、8h取發(fā)酵樣品，每個樣品做三個平行實驗按參考文獻[9]進行乳酸菌活菌計數(shù)。

1.2.5 實驗數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)酸變化

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸的過程間接反映了細菌生長過程，圖1反映了12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基乳酸菌生長過程中補加6mol/L NH4OH的變化情況。柱狀圖表示整個過程累積加堿的總量變化，折線圖表示每0.1h單位時間加堿的變化情況，整個發(fā)酵過程共8h，大多數(shù)時間里，單位時間滴加堿量在1mL以下，總消耗NH4OH為53.598mL。從柱狀圖來看，發(fā)酵0.71h開始滴加堿液，一直到發(fā)酵結(jié)束產(chǎn)酸總量呈緩慢的趨勢上升，說明細胞產(chǎn)酸（生長）維持一個相對穩(wěn)定的水平。圖1中單位時間滴加堿量反映產(chǎn)酸的量，可將折線圖看作是比生長速率μX，間接指示乳酸菌的比生長速率。從折線圖的變化來看，開始到0.71h為0mL/0.1h，說明細菌的數(shù)量幾乎沒有增加，細菌生長處于一個延遲階段。隨后呈現(xiàn)一個急速的上升階段，在1.10h時達到最大值為2.169mL/0.1h，表明細菌生長進入對數(shù)期，從1.10～3.60h加堿量維持在1.0mL/0.1h水平上下波動，說明此階段處于對數(shù)生長期，細菌生長旺盛。從3.61～4.81h滴加堿量有所下降但很能維持在相對較高的水平，平均為0.70mL/0.1h，表明細菌生長處于穩(wěn)定期。從4.91h至發(fā)酵結(jié)束加堿量在0.5mL/0.1h以下，反映細菌生長呈現(xiàn)下降趨勢。

圖1 乳酸菌在12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基中生長滴加堿量變化Fig.1 Cumulative volume of dropping NH4OH LAB growing in 12g/100mL skim milk

圖2 乳酸菌在添加增殖復合劑12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基中生長滴加堿量變化Fig.2 Cumulative volume of dropping NH4OH of LAB growing in 12g/100mL skim milk adjunct SPH complex

圖2為12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基中添加大豆蛋白水解物增殖復合劑的乳酸菌發(fā)酵過程加堿量變化情況，與12g/100mL脫脂乳對照培養(yǎng)基相比，可以看出幾點明顯差異：a.總加堿量為167.329mL，是脫脂乳的3.12倍，相應的細胞數(shù)量大幅度增加，說明添加增殖復合劑的效果極其顯著；b.從柱狀圖來看，1.00～5.20h產(chǎn)酸量沿著一個很陡的上升趨勢增加，說明這階段是細菌的快速生長期即對數(shù)期，5.30h到發(fā)酵結(jié)束產(chǎn)酸量變化趨緩，穩(wěn)定在一定的生長水平，維持在穩(wěn)定期；c.從折線圖滴加堿量變化來看，0～0.90h為延遲期；1.00～3.50h單位時間加堿量呈直線上升階段，為對數(shù)生長期，3.50～3.60h達到最大值5.348mL/0.1h；隨后呈下降趨勢，到5.20h仍維持在4.0mL以上，說明該階段細菌生長由對數(shù)期向穩(wěn)定期過渡；從5.30h開始進入一個明顯的下降通道，滴加堿量維持在2.0mL/0.1h以下，細菌生長處于一個穩(wěn)定階段，結(jié)合柱狀圖說明細胞數(shù)量逐漸增加，然后趨于穩(wěn)定。

圖3 乳酸菌在添加酵母膏12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基中生長滴加堿量變化Fig.3 Cumulative volume of dropping NH4OH LAB growing in 12g/100mL skim milk adjunct yeast extract

在12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基中添加0.5%酵母膏乳酸菌發(fā)酵滴加堿量變化如圖3所示，從柱狀圖可以看出累積加堿量三級臺階式，而折線圖呈現(xiàn)的波浪式的三個階段。8h發(fā)酵總消耗堿量為110.196mL，為脫脂乳發(fā)酵的2倍，為添加增殖復合劑的三分之二。單位時間最大加堿量為2.294mL，是脫脂乳發(fā)酵平均數(shù)值的2倍多，卻只有添加增殖復合劑的二分之一。

第一次快速產(chǎn)酸階段是0.61～1.91h，產(chǎn)酸累積量為15.26mL。此階段的單位時間產(chǎn)酸量開始快速上升，然后迅速消落，維持在1.0～2.0mL/0.1h之間。此階段可能是由于培養(yǎng)基中添加了酵母膏，為培養(yǎng)基補充一定量的游離氨基酸和短肽，使細菌處于一個快速生長過程，但因為氮源數(shù)量有限使細菌生長速度暫時回落。第二個快速產(chǎn)酸階段為2.01～5.21h，產(chǎn)酸累積為43.47mL。此階段的前半階段2.01～3.01h加堿量在1.0mL以下是一個準備階段，然后進入迅速上升階段（3.11～4.31h）。滴加堿量從1.0mL升到2.294mL，此階段細菌生長快速，獲得較大細胞量，隨后又呈下降趨勢（4.41～5.21h）。乳酸菌經(jīng)過第一階段后，雖然生長速度暫時放緩，但細菌數(shù)量已經(jīng)達到較高的水平，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌二者協(xié)同生長后，具有較強的分解酪蛋白的能力。從圖的變化來看，表明在培養(yǎng)基中已經(jīng)具有一定量的短肽和氨基酸，與酵母膏一同推動細菌的快速生長。第三個階段為5.31～8.01h，由于產(chǎn)酸累積量維持一個緩慢的上升趨勢，經(jīng)過一個小幅上升后很快回落到一個穩(wěn)定的水平，表明細菌生長趨于穩(wěn)定后期。

2.2 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量變化

在小型發(fā)酵實驗過程中，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合生長細胞數(shù)量變化如圖4所示，三種培養(yǎng)基中乳酸菌生長從2h到6h處于上升的通道中，6h后下降，幾乎與單位時間滴定堿量變化同步。乳酸菌數(shù)量由最初的106cfu/mL分別升高至109和1010數(shù)量級。三種培養(yǎng)基乳酸菌生長的柱狀圖表明，6h后12g/100mL脫脂乳培養(yǎng)基乳酸菌生長細胞數(shù)量最低，添加酵母膏的細胞數(shù)量比12g/100mL脫脂乳提高1個數(shù)量級，p＜0.05，增殖效果顯著；添加增殖復合劑的細胞數(shù)量比12g/100mL脫脂乳提高近2個數(shù)量級，p＜0.01，增殖效果極顯著。發(fā)酵實驗結(jié)果表明大豆蛋白水解物增殖復合劑對乳酸菌生長具有顯著的促進作用。

圖4 在發(fā)酵罐三種培養(yǎng)基中乳酸菌生長細菌數(shù)比較Fig.4 Comparison on growth of Lb.and St.in three media fermenting in bioreactor

3 結(jié)論

在乳培養(yǎng)基中添加大豆蛋白水解物進行乳酸菌發(fā)酵研究，從累積流加6mol/L NH4OH總量反映的產(chǎn)酸量指標來看，添加酵母膏比12g/100mL脫脂乳增加1倍，添加增殖復合劑比12g/100mL脫脂乳增加2.12倍，說明大豆蛋白水解物增殖復合劑對乳酸菌生長具有非常顯著的促進作用。從單位時間滴加堿量指標反映乳酸菌的生長過程來看，12g/100mL脫脂乳中乳酸菌生長呈現(xiàn)一個緩慢的上升趨勢，為一個典型的細菌生長曲線；添加酵母膏后呈現(xiàn)三階段波浪式曲線，可能與培養(yǎng)基中氨基酸和小肽的含量變化相關(guān)；添加增殖復合劑后表現(xiàn)為比較陡峭的上升曲線，然后緩慢回落到一個穩(wěn)定的水平，表明大豆蛋白水解物后比添加酵母膏更能夠使乳酸菌生長維持一個較高水平。從乳酸菌數(shù)量的變化來看，發(fā)酵6h是最佳收獲期，添加增殖復合劑可使乳酸菌數(shù)量達到10個數(shù)量級，與單獨使用脫脂乳和添加酵母膏相比，細菌數(shù)量可提高1.0～2.0個數(shù)量級，增殖效果顯著。

乳是生產(chǎn)乳酸菌直投式發(fā)酵劑的廉價培養(yǎng)基，但由于乳酸菌本身不能合成各種氨基酸和維生素，乳培養(yǎng)基不能滿足乳酸菌高密度生長的需要。在大規(guī)模培養(yǎng)乳酸菌時，在培養(yǎng)基中添加一些富含有短肽、氨基酸和維生素等生長因子的廉價蛋白水解物是促進乳酸菌增殖，獲得高密度乳酸菌活性細胞的有效方法。應用小型生物發(fā)酵罐對乳酸菌發(fā)酵實驗研究，在脫脂乳培養(yǎng)基中，添加含有大豆蛋白水解物的復合增殖劑對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合生長具有明顯的促進作用，對乳酸菌直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)具有非常重要的應用價值。

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Study on soy protein promoting proliferation fermention of lactic acid bacteria

BAI Feng-ling1，QU Ling-tong1，ZHANG Bo-lin2，ZHAO Hong-fei2
（1.College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou，Liaoning 121013，China；2.College of Biological Science and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0209-04

2012-01-13

白鳳翎（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)與食品安全。

國家863計劃（2006AA10Z344）；國家863計劃（2008AA10Z335）；遼寧省高校重大科技平臺開放課題（LNSAKF2011011）。